《Aquaculture》：Development and validation of a new SYBR green-based qPCR assay for the broad detection of
Novirhabdovirus salmonid (IHNV) genotypes
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摘要传染性造血坏死病毒（IHNV）是一种需向世界动物卫生组织报告的病原体，会给全球鲑鱼养殖业带来严重经济损失。虽然目前国际上推荐使用TaqMan检测方法，但由于检测成本较高，且探针结合区域存在的单核苷酸多态性，该方法的诊断效果在针对某些基因型时会出现下降，尤其是JS谱系。为解决这
摘要
传染性造血坏死病毒（IHNV）是一种需向世界动物卫生组织报告的病原体，会给全球鲑鱼养殖业带来严重经济损失。虽然目前国际上推荐使用TaqMan检测方法，但由于检测成本较高，且探针结合区域存在的单核苷酸多态性，该方法的诊断效果在针对某些基因型时会出现下降，尤其是JS谱系。为解决这些问题，本研究开发了一种基于SYBR Green的qPCR检测方法，该方法以高度保守的核蛋白（N）基因为检测目标。通过优化引物组的热力学参数，包括GC含量、熔解温度以及吉布斯自由能，确保该方法能够检测多种基因型（U、M、E、JN和JS），同时避免非特异性扩增和引物二聚体的产生。实验结果显示，该检测方法在检测JS基因型时具有更优的性能，其Cq值仅为16.69，远低于存在探针不匹配问题的WOAH检测方法的20.30。该方法的最低检测限为16.92个拷贝/反应，在实验感染的样本中具有100%的诊断敏感性和特异性。通过对韩国和波兰的123份野外样本进行验证，该新方法发现了8份原本被WOAH推荐方法遗漏的IHNV阳性样本，这些样本随后都通过测序得到了确认。由于该方法的变异系数始终低于5%，且在七家实验室中均表现出良好的重复性，因此它是一种比基于探针的方法更为可靠、灵敏且经济高效的替代方案，尤其适用于资源有限的地区，那里需要检测多种病毒突变。
引言
传染性造血坏死病毒（IHNV）是引发传染性造血坏死病（IHN）的病原体，这种疾病需向世界动物卫生组织报告（WOAH，2021；第2.3.5章）。IHNV是一种对鲑鱼养殖业危害极大的病毒病原体，主要影响北美洲、欧洲和亚洲的虹鳟鱼养殖业（Kim等人，2007；Xu等人，2019）。鲑鱼养殖业的全球发展在很大程度上依赖于受精卵的国际贸易，而这带来了病毒跨区域传播的风险，也可能将新的基因型引入免疫系统尚未接触过这类病毒的鱼类群体中（WOAH，2021；第2.3.5章）。
IHNV的基因型可按地理区域分为五类：北美洲的有L、M和U三类；欧洲的有E类；日本和韩国的有J类（Kurath等人，2003；Enzmann等人，2005）。在J基因型中，又可进一步分为JRt长野株（JN）和JRt静冈株（JS）两类，这两种株系在韩国的虹鳟鱼养殖场中较为常见（Kim等人，2007；Lim等人，2021）。自1991年首次发现该病毒以来，韩国仅报道过J基因型，它会导致幼鱼出现严重的出血性坏死症状，并造成高死亡率（Park等人，1993；Kim等人，2007）。
韩国一直从挪威、美国和丹麦等IHNV流行国家进口受精鲑鱼卵和幼鱼，只有经过WOAH标准认证、不存在该病毒及ISAV病毒的受精卵才能用于养殖业（韩国国家水产品质量管理体系，2019；WOAH，2019；美国农业部动植物卫生检验局，2025）。目前用于检测IHNV的诊断方法主要以WOAH推荐的逆转录定量PCR技术为主，该技术使用针对病毒核蛋白（N）基因的探针（TaqMan探针）进行检测（WOAH，2021；第2.3.5章）。然而，先前的研究发现在FV23、FV91–40和D332–92等毒株中，检测结果存在不确定性，比如扩增曲线不清晰、荧光信号较弱，这些都可能导致误判（Hoferer等人，2019；Purcell等人，2013）。
这表明基于探针的检测方法在诊断方面存在明显局限性，尤其是在针对不同基因型的检测灵敏度方面。Purcell等人（2013）最早发现JS基因型的探针结合区域存在一个关键的单核苷酸多态性。这类差异，尤其是出现在对探针结合至关重要的位置时，会显著降低探针的杂交效率，从而导致扩增曲线异常、荧光信号弱，以及误阴性的风险上升（Hoferer等人，2019；Purcell等人，2013）。此外，TaqMan探针试剂的价格高昂，且检测需要专用设备，这使得许多检测实验室难以长期持续开展常规监测工作（Ponchel等人，2003；Bohara等人，2022）。
为克服这些难题，迫切需要一种更为可靠且经济高效的诊断方法。基于SYBR Green的qPCR检测方法具有诸多优势，比如成本低廉、对序列差异的容忍度更高，而且检测设计较为简单，既适合在实验室中使用，也适用于野外检测（Bustin等人，2005；Wong和Medrano，2005）。尽管SYBR Green化学体系存在一些固有问题，比如由于其DNA结合不具有序列特异性，可能会引发非特异性扩增和引物二聚体形成，但通过严格的引物设计以及系统的检测优化，这些问题已经得到了有效控制（Bustin等人，2005；Wong和Medrano，2005）。通过精准调控引物的GC含量、熔解温度以及吉布斯自由能，可以有效避免非特异性扩增和引物二聚体形成，这些是SYBR Green检测中常见的问题，同时还能提升检测的容错能力和效率（Wong和Medrano，2005；Chico等人，2006；Bustin等人，2005）。这种方法能够确保稳定检测各种IHNV基因型，包括问题较多的JS谱系，同时避免非特异性扩增和引物二聚体形成等问题（Purcell等人，2013；Batts等人，2022）。
本研究旨在开发并验证一种基于SYBR Green的qPCR检测方法，该方法以IHNV N基因的保守区域为检测靶标，可实现多种基因型的广泛检测（U、M、E、JN和JS）。首先通过确定合适的引物特性，包括GC含量、熔解温度和吉布斯自由能，来评估新检测方法的可靠性。之后通过将该引物组合的检测灵敏度和特异性与WOAH推荐的基于探针的RT-qPCR方法进行对比，进一步评估其性能。为确保检测结果的可靠性，我们还测试了该方法的重复性和再现性。此外，还使用实验感染的鱼类样本评估了该方法的诊断灵敏度和特异性。最后，通过分析国内外的野外样本，验证了该方法在实际应用中的可行性，以确保其在临床检测中的可靠性。
章节节选
病毒株和细胞系
本研究使用的IHNV基因型包括U（Baker株）、M（220–90株）、E（32–87株）、JN（RtPc22株）和JS（RTYK1801株）（见表1）。这些病毒在Leibovitz's L-15培养基（Gibco公司，美国）中培养，培养基中还添加了10%的胎牛血清（HI FBS，Gibco公司）以及1%的抗生素-抗真菌剂（Gibco公司），培养温度为20℃，培养细胞为鲤鱼乳头状上皮瘤细胞（EPC细胞）（WOAH，2021，第2.3.5章）。从培养上清液中提取的病毒菌株则储存在-70℃条件下，待用于检测方法开发或感染实验时再取出使用。
基因型覆盖范围和引物特异性
新开发的基于SYBR Green的qPCR检测方法能够成功扩增所有五种主要的IHNV基因型（U、M、JS、JN和E），扩增曲线十分稳定（见图1），且每个基因型都只出现一个熔解峰。在该检测方法中，各基因型的Cq值分别为：U株为13.33，M株为14.81，JN株为14.83，JS株为16.69，E株为16.38；而WOAH推荐的基于探针的RT-qPCR方法对应的Cq值分别为：U株为14.36，M株为16.12，JN株为16.42，JS株为20.30，阴性对照组则没有检测到扩增信号（见表3）。确实，WOAH推荐的基于探针的RT-qPCR方法
讨论
本研究解决了当探针结合区域存在序列变异时，WOAH推荐的基于探针的RT-qPCR方法所存在的缺陷。在所有测试的IHNV基因型中，JS基因型的两种检测方法之间的Cq值差异最大。对于JS基因型，基于探针的RT-qPCR方法的Cq值比基于SYBR Green的qPCR方法大约高出3.6。由于两种方法使用的cDNA制备材料相同，模板输入量也相当，因此出现的这种差异
CRediT作者贡献说明
Sungjae Ko：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，验证，软件应用，正式分析，数据整理，概念构建。Eunsu Song：撰写——初稿，可视化，验证，软件应用，实验研究，正式分析，数据整理。Magdalena Stachnik：验证，软件应用，方法学研究，正式分析，数据整理。Bertrand Collet：撰写——审稿与编辑，验证，正式分析，数据整理。Bartolomeo Gorgoglione：撰写——审稿与
伦理审批情况
在韩国进行的所有实验程序均遵循江陵原州国立大学的动物福利管理与使用指南（GWNU-2023-29）。
所有的动物感染实验和采样操作都在法国C78-720法规允许进行动物实验的INRAE-IERP鱼类养殖设施中进行。这些实验都是按照欧洲关于保护用于科学研究的动物的相关指南来开展的。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了韩国国家水产品质量管理体系的资助（项目名称：水生生物检疫与疾病控制计划研发，项目编号：NFQS 2026001）。
此外，INRAE与韩国国家水产品质量管理体系之间也存在合作协议。作者们要感谢IERP鱼类养殖设施的工作人员，以及Damien Degallaix在实验过程中为鱼类供应和技术支持方面所提供的帮助。
Sungjae Ko|Eunsu Song|Magdalena Stachnik|Bertrand Collet|Bartolomeo Gorgoglione|Po-Tsang Lee|Alejandro J. Yá?ez|Joon Bum Jeong|Kwangil Kim|Youngchul Kim|Dimitri Rigaudeau|Mun Gyeong Kwon|Jae-Ok Kim|Min Jae Kim|Ji-Min Jeong|Suhee Hong
韩国江原大学水生医学系，江陵市25457
