优化金头鲷（Sparus aurata）SaB-1细胞中RNA递送策略

《Fishes》：Optimizing RNA Delivery Strategies for Gilthead Seabream (Sparus aurata) SaB-1 Cells

　　

水产养殖是全球增长最快的食品生产部门，然而它面临着重大挑战，包括对养殖物种生物学理解的有限。在此背景下，细胞系在研究复杂性状及其遗传基础方面变得越来越重要。分子工具（如RNA干扰（RNAi）和基因组编辑）的体外应用可以帮助解析目标性状的分子基础。然而，缺乏体外操作方案限制了该领域的进展。在此，研究人员优化了源自金头鲷（Sparus aurata）的SaB-1细胞中的RNA转染方案，金头鲷是地中海水产养殖中最重要的养殖物种之一。尽管其重要性，但迄今为止对该物种的体外研究很少。研究人员的实验结果表明，在该细胞系中，RNA递送可以通过电穿孔或基于FUGENE^?-SI的化学转染实现，尽管电穿孔导致较低的存活率（约35%，而化学转染为76%）。最后，作为概念验证，两种递送策略均在CRISPR/Cas9介导的gfap基因编辑中进行了测试，编辑效率约为10%。该研究为水产养殖功能基因组学提供了有用的方法学进展，提供了能够实现基因组编辑策略的RNA递送方法，并可加速金头鲷的分子研究和性状改良。

**论文解读：金头鲷SaB-1细胞RNA递送策略的优化与应用**

**研究背景与问题**
水产养殖是全球增长最快的食品生产部门，2022年水产养殖占全球水生动物产量的51%，首次超过捕捞渔业。金头鲷（Sparus aurata）是南欧产量最高的养殖鱼类，经济价值仅次于欧洲鲈鱼，但对其生理、病原易感性等生物学特性的理解仍有限。基因沉默和基因组编辑技术（如RNA干扰（RNAi）和CRISPR/Cas9）是解析基因功能、改良动物健康与生长的重要工具，但体外模型的应用受到缺乏高效核酸递送方案的制约。目前，金头鲷仅有16个细胞系，其中SaB-1是唯一源自脑组织的神经干细胞系，可用于研究神经相关疾病（如病毒性神经坏死VNN），但此前仅少数研究涉及核酸递送，缺乏系统优化的RNA递送方案。因此，研究人员开展本研究，旨在优化SaB-1细胞中的RNA递送策略，为功能基因组学提供方法学基础。论文发表在《Fishes》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用荧光标记的tracrRNA-ATTO^?488作为报告RNA，通过流式细胞术（CytoFLEX）评估递送效率（以FITC通道荧光阳性细胞百分比表示），并用MTT法测定细胞活力。样本来源为SaB-1细胞系（RRID: CVCL_A9H7），源自金头鲷。电穿孔采用Neon NxT电穿孔系统，化学转染使用FUGENE^? SI试剂。作为概念验证，研究人员将Cas9 mRNA和sgRNA（靶向gfap基因）通过两种优化方案递送，通过Sanger测序和TIDE分析（Tracking of Indels by Decomposition）评估编辑效率。

**研究结果**

**3.1 电穿孔导致高RNA递送但低细胞存活率**
研究人员测试了三种RNA浓度（10、20、30 pmol）与三种电穿孔参数（1400 V 20 ms 1脉冲；1400 V 20 ms 2脉冲；1650 V 15 ms 2脉冲）的组合，发现30 pmol RNA搭配1650 V 15 ms 2脉冲获得最高荧光阳性细胞比例（67.05% ± 15.22%），但细胞存活率整体较低（约30%）。进一步优化参数（包括1700 V 10 ms 3脉冲）后，该条件达到最高递送效率（75.55% ± 23.24%），且显著优于1400 V 20 ms 1脉冲。两种重悬缓冲液（buffer R和Opti-MEM）对递送效率和存活率无显著影响，表明Opti-MEM可替代buffer R以降低成本。

**3.2 使用FUGENE^? SI实现高RNA递送和细胞存活率**
化学转染测试了0.1–30 pmol RNA浓度，发现单独RNA（无FUGENE^? SI）时转染效率<1%；加入FUGENE^? SI后，≥2.5 pmol RNA即可获得>80%荧光阳性细胞，10 pmol RNA时达到最高效率（92.32% ± 2.86%），且细胞存活率较高（75.76% ± 4.96%）。RNA浓度是影响存活率的主要因素，而非转染试剂。该结果提示10 pmol RNA是未来基因沉默实验的合适起始浓度。

**3.3 优化方案在CRISPR/Cas9基因组编辑中的验证**
两种优化方案用于递送CRISPR/Cas9组分（Cas9 mRNA和sgRNA）以编辑gfap基因。转染后第4天，电穿孔和FUGENE^? SI的编辑效率分别为12.1% ± 5.68%和10.1% ± 6.47%，无显著差异；第7天时效率分别为10.7% ± 3.96%和5.85% ± 2.28%，仍无显著差异，表明编辑细胞比例稳定。尽管编辑效率中等，但稳定存在提示未来可通过单细胞分离扩增获得均匀编辑的克隆。

**讨论与结论**
研究人员比较了两种递送方法：电穿孔虽能高效递送RNA，但细胞毒性大（仅约30%存活），适合递送多种货物（如核糖核蛋白RNP）；FUGENE^? SI化学转染效率更高（>90%）、存活率更高（约76%），但可能受限于大分子（如Cas9 mRNA）的共递送效率。本研究首次系统优化了金头鲷细胞系中裸RNA的电穿孔递送，并首次在鱼类细胞系中测试FUGENE^? SI。研究结论：总之，电穿孔和化学转染（FUGENE^? SI）均是适用于金头鲷SaB-1脑细胞系RNA递送的方法，尽管电穿孔导致相对较高的细胞死亡率。本研究展示的实验表明，在所测试的条件中，最佳的RNA电穿孔条件需要30 pmol RNA和1700 V、10 ms、3个脉冲。对于化学试剂FUGENE^? SI的RNA递送，仅需10 pmol RNA即可实现。作为概念验证，两种方法均用于CRISPR/Cas9递送以编辑gfap，获得了约10%的编辑效率。该研究为水产养殖功能基因组学提供了有用的方法学进展，提供了新的策略，有助于加速金头鲷的分子研究和性状改良。