《Journal of Cardiovascular Development and Disease》：Impact of miR-1/miR-133 Cluster in Cardiogenesis and Heart Failure
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心脏发生始于原肠胚形成阶段，胚胎双侧预心脏中胚层的特化是其起始标志。两侧中胚层场在胚胎中线融合形成线性心管，随后经历右向环化与心室、心房腔室形成。原始心房与心室腔的扩张及室间隔分隔，最终建立体循环与肺循环通路，并保证流入道与流出道的精准对齐。上述形态发生事件依
心脏发生始于原肠胚形成阶段，胚胎双侧预心脏中胚层的特化是其起始标志。两侧中胚层场在胚胎中线融合形成线性心管，随后经历右向环化与心室、心房腔室形成。原始心房与心室腔的扩张及室间隔分隔，最终建立体循环与肺循环通路，并保证流入道与流出道的精准对齐。上述形态发生事件依赖于细胞类型特异性心脏基因程序的协同激活与抑制，该过程受心脏转录因子及旁分泌/自分泌信号在转录与转录后水平的精密调控。非编码RNA，尤其是microRNA（miRNA）与长非编码RNA（lncRNA），构成了关键的调控层级。miRNA是一类长度约22 nt的内源性非编码RNA，主要通过转录后机制调控基因表达。肌肉富集的miR-1/miR-133簇是正常心脏发生所必需的调控因子，而miR-1与miR-133的失调则参与心力衰竭及其相关病理进程的发生发展。研究人员在此对miR-1/miR-133簇在心脏发生与心力衰竭中的基因组调控、发育功能、环境依赖性互作及转化潜力进行了系统性综述。
1. Introduction
长期以来，非编码RNA（ncRNA）曾被视为基因组中的非功能性转录产物，研究重心长期聚焦于编码RNA的生物学功能。人类基因组测序及ENCODE计划的完成揭示，超过80%的基因组可被转录为各类RNA，其中编码RNA占比不足2%，提示ncRNA的生物学重要性不亚于甚至超过编码RNA。目前研究已证实，ncRNA在细胞发育、分化、生长、稳态维持及疾病发生等通路中发挥核心调控作用。依据长度与结构特征，ncRNA可分为三类：短链/小非编码RNA（≤200 nt），包括miRNA、snoRNA、piRNA及tRNA；长非编码RNA（>200 nt），包括内含子型、增强子型、环状及基因间区长非编码RNA（lncRNA）；以及无游离末端的环状RNA（circRNA）。miRNA长度约20–22 nt，主要通过与靶RNA的3'非翻译区（3'UTR）碱基互补配对，在转录后水平抑制基因表达，诱导mRNA降解或翻译抑制。初级miRNA（pri-miRNA）经Drosha–DGCR8微处理器复合体加工后，通过Exportin-5/Ran-GTP通路转运至胞质，再由Dicer酶切割，最终其中一条链被装载至含Argonaute（AGO）的RNA诱导沉默复合体（RISC）中发挥调控功能。除经典胞质通路外，核内miRNA还可调控转录、染色质状态及转录因子活性，但其具体机制尚未完全阐明。miRNA作为细胞进程的关键调控因子，参与细胞增殖、分化、稳态维持及细胞谱系特化；其表达异常与多种疾病密切相关，并已成为潜在治疗靶点。心脏发生作为受转录与转录后调控因子精密调控的复杂过程，其基因程序紊乱可导致多种致死性心血管疾病。心脏发生的转录调控由Mesp1/2、Gata4、Nkx2.5、Srf、Pitx2c、Mef2c等转录因子，Hdac2、Hdac4等染色质重塑因子，以及Wnt、Fgfs等旁分泌信号共同介导；而转录后调控则主要由miRNA与lncRNA执行。Dicer条件性敲除小鼠模型最早证实miRNA对心脏发生的必要性，该模型表现为右室双出口合并室间隔缺损。后续针对miR-1、miR-133、miR-17、miR-92、miR-138等miRNA的敲除研究，进一步明确了miRNA在心脏前体细胞向心肌谱系特化中的核心作用；miR-208a/b与miR-499则被证实调控晚期心脏发生，维持慢/快肌纤维基因的正确表达与肌节收缩功能。本综述系统阐述了miR-1/miR-133簇在心脏发育、心力衰竭及其相关病理过程（包括心脏纤维化、心肌细胞肥大、血管生成及炎症反应）中的调控作用。
2. Genomic Organization and Transcriptional Regulation of miR-1/miR-133 Cluster
miR-1与miR-133在不同物种间高度保守，二者源自同一双顺反子初级转录本，由三个独立基因簇编码：miR-1-1/miR-133a-2基因簇位于人类20号染色体与小鼠2号染色体的基因间区，编码miR-1-1与miR-133a-2；miR-1-2/miR-133a基因簇位于人类与小鼠18号染色体上mindbomb泛素蛋白连接酶E3（Mib1）基因第12内含子的反义链，编码miR-1-2与miR-133a；miR-206/miR-133b基因簇位于人类6号染色体与小鼠1号染色体，编码miR-206与miR-133b。不同基因簇来源的miR-1-1/1-2与miR-133a/133a-2成熟序列完全一致，miR-206与miR-1-1/1-2仅存在4个核苷酸差异，miR-133b与miR-133a仅3'端单个核苷酸不同。miR-1-1/miR-133a-2与miR-1-2/miR-133a在骨骼肌与心肌中高表达，而miR-206/miR-133b仅在发育期与成年期骨骼肌中表达。miR-1与miR-133的转录由MyoD、血清响应因子（Srf）及肌细胞增强因子2（Mef2）等转录因子直接调控：MyoD特异性调控骨骼肌中二者的表达；Srf与Mef2则在心肌、骨骼肌及平滑肌中广泛调控其转录。Srf识别并结合miR-1-1/miR-133a-2与miR-1-2/miR-133a基因簇上游高度保守的增强子序列，分别位于转录起始位点上游2.6 kb与0.6 kb处，该结合驱动miR-1/miR-133在心室与流出道的表达，但不调控心房区域。尽管上游增强子含MEF2结合基序，但其对心脏活性并非必需。Mef2增强子则位于miR-1-2/miR-133a基因簇的内含子区肌肉特异性增强子内，在心室与心房均具活性，该区域在miR-1-1/miR-133a-2基因簇中不存在。转基因模型证实，上述上游与内含子增强子自胚胎第8.5天（E8.5）起激活，是早期心脏发生所必需的。除经典胞质功能外，miR-133a还存在非经典核功能：其通过Wnt信号抑制与AGO2依赖的方式转运至细胞核，与AGO2形成复合物后结合输入蛋白β家族成员IPO8，介导该复合物从胞质向核内转运。入核后，miR-133a/AGO2复合物通过表观遗传重编程调控新生DNA甲基转移酶3B（Dnmt3b）启动子，诱导Dnmt3b自身启动子甲基化，形成负反馈环路。功能实验证实，该核功能调控人多能干细胞（hPSC）向心肌细胞分化早期Dnmt3b的正确转录，保障心肌细胞的正常分化与成熟。目前尚未在心肌细胞中证实miR-1的核功能，其是否以AGO2复合物形式入核、是否靶向启动子DNA、新生RNA或染色质相关lncRNA，仍需进一步验证。miR-1与miR-133的亚细胞功能解析，对理解同一双顺反子转录本如何在心脏发生与心血管疾病中协调转录后抑制与潜在的转录/表观遗传调控至关重要。综上，miR-1/miR-133簇的基因组组织、增强子依赖的转录调控及新兴的核功能，构成了在转录、转录后与表观遗传水平协同调控心脏基因表达的多层级系统。
3. Gene Expression Patterning of miR-1 and miR-133 During Cardiogenesis
原位杂交分析显示，miR-1与miR-133在小鼠与鸡胚胎心脏发生过程中广泛表达。在小鼠胚胎中，二者最早于E8.5原始心管及E9.5心管环化阶段可检测到，自E10.5至成年期在心室与心房心肌中持续高表达。在鸡胚胎中，二者表达起始更早：miR-1与miR-133a自原始心管内皮管（HH8期）、原始心管（HH10期）至心环化早期均有表达，且表达强度呈前-后轴递减趋势，流入道区域表达消失，仅保留于原始心室。miR-133a在鸡胚胎更早阶段（HH3期原始条纹预心脏细胞及HH5期第一心域）即可被检测到。在爪蟾与斑马鱼等物种中，miR-1与miR-133a仅在肌肉前体细胞中表达，而在发育中的胚胎心脏中未被检测到，提示其在心脏发生阶段的特异性表达可能是羊膜动物特有的特征。但该物种差异需谨慎解读，低水平或瞬时表达可能低于整体胚胎原位杂交的检测灵敏度，且探针可能无法区分不同旁系同源体。进化上，成熟miRNA序列与核心心脏转录因子高度保守，而调控心脏表达的顺式调控增强子可能发生分化，非羊膜动物可能通过不同的增强子-因子组合、表达窗口或功能冗余miRNA调控同源靶基因。空间小RNA测序、基因座特异性敲入报告系统及比较增强子可及性分析，是区分真实表达缺失与低水平、阶段限制性表达的关键手段。综上，miR-1与miR-133序列高度保守，但其心脏表达模式存在物种特异性，凸显顺式调控分化在塑造心脏发生过程中时空表达活性中的核心作用。
4. Functional Role of miR-1 and miR-133 in Cardiogenesis and Cardiomyocyte Differentiation
4.1. Role of miR-1 and miR-133 in Heart Development
体内功能获得与功能缺失突变小鼠模型明确了miR-1与miR-133在心脏发育中的核心作用。β-肌球蛋白重链（β-MHC）启动子驱动miR-1过表达的转基因小鼠于E13.5出现发育停滞，表现为心室腔形成缺陷与心功能衰竭；其心室壁变薄，仅由3–5层心肌细胞构成（对照组为8–10层），心肌细胞增殖显著减少但凋亡未增加，最终导致心室腔扩张失败与胚胎血流供应中断。机制上，miR-1通过靶向结合Hand2 mRNA诱导其降解，抑制Hand2翻译，导致心肌细胞过早分化与细胞周期提前退出，与Hand2敲除小鼠的右心室发育不良及左室小梁减少表型一致。miR-1-2敲除小鼠表型较过表达模型轻微，约50%个体于胚胎晚期至新生期死亡，存活个体表现为室性心律失常，部分死亡个体合并室间隔缺损（VSD）；突变体心肌细胞呈现细胞周期异常，出生后核分裂持续存在，伴随Hand2、Hrt2/Hey2、Hand1、Gata5等VSD相关基因上调，且miR-1-1表达未代偿性上调，提示miR-1-1与miR-1-2功能非完全冗余。单独敲除miR-133a-1或miR-133a-2的小鼠无显著病理表型；而双敲除（dKO）小鼠约50%于胚胎期因VSD死亡，存活个体发展为扩张型心肌病与心力衰竭，表现为右心室游离壁变薄、心室腔扩张、室间隔细胞减少，伴随平滑肌基因程序（平滑肌肌动蛋白、Transgelin、Caldesmon 1、Calponin 3）异常激活与CyclinD1/D2上调导致的增殖紊乱；反之，miR-133a过表达则抑制心肌细胞增殖，导致心室壁变薄与VSD，证实miR-133a通过抑制增殖与阻断平滑肌谱系分化维持心肌身份。miR-1/miR-133双敲除小鼠于E11.5前死亡，表现为心室壁显著变薄、心肌细胞增殖严重受损及未成熟混合表型，伴随平滑肌调控因子Myocardin上调，提示二者协同调控心肌细胞谱系特化与分化。在禽类模型中，miR-1与miR-133a通过拮抗调控视黄酸（RA）信号通路决定后心脏区域及其衍生结构的边界：miR-133a通过抑制RhoA与Cdc42下调Raldh2表达，抑制RA信号，其表达下调导致Raldh2上调、RA信号增强，引起原始心房与静脉窦心肌细胞增殖减少与发育不良；miR-1则通过上调CrabpII与Rarβ增强RA信号，促进Amhc1、Gata4、Tbx5表达并抑制Mef2c，导致原始心房与静脉窦心肌细胞过度增殖与增生。综上，miR-1与miR-133是剂量敏感、环境依赖的心脏发生调控因子，其功能关系取决于剂量、发育阶段、细胞背景及所调控的生物学进程。
4.2. Functional Role of miR-1 and miR-133 in Mesoderm and Cardiomyocyte Differentiation
体外研究证实，miR-1与miR-133是胚胎干细胞（ESC）中胚层前体向心肌谱系分化的必需调控因子。miR-1上调促进ESC向中胚层谱系分化，上调Nkx2.5与Cdk9表达，同时抑制内胚层、神经外胚层与外胚层分化；其定位于胚胎体肌球蛋白阳性细胞中，且Srf介导的miR-1上调可抑制Notch配体Delta Like-1（Dll1），阻断非肌肉谱系分化。miR-133则通过靶向Egfr抑制外胚层分化。在人ESC来源的多能心血管祖细胞（MCP）中，miR-1上调通过靶向Frizzled-7（Fzd7）与成纤维细胞生长因子受体底物2（Frs2）抑制Wnt与Fgf信号，定向促进心肌细胞分化；而miR-133则通过下调Nkx2.5、Gata4、Mef2c等心脏标志物，抑制ESC向心肌前体分化。在鸡胚胎预心脏区域注射miR-133a可下调Fgf8、上调Bmp2，促进中胚层衍生物的心肌诱导。综上，miR-1与miR-133在间充质与心脏分化中发挥互补且阶段依赖的功能：miR-1持续促进肌源性及心肌谱系特化，激活心脏转录程序并抑制替代谱系信号；miR-133则抑制外胚层分化，通过调控Fgf8/Bmp2信号促进早期心脏中胚层诱导，同时限制ESC向心肌前体的后续转化，二者通过动态平衡调控谱系特化、前体维持与终末分化。
4.3. Role of miR-1 and miR-133 in Cellular Reprogramming
miR-1与miR-133是介导成纤维细胞重编程为诱导心肌样细胞（iCM）的核心组分。将驻留成纤维细胞重编程为功能性心肌细胞是心肌梗死（MI）等心肌损伤再生治疗的潜在策略。miR-1、miR-133联合miR-208与miR-499（miR-Combo）的体内外递送，可诱导成纤维细胞向iCM转化，上调Nkx2-5、Gata4、Tbx5、Islet1、Mef2c等早期心脏标志物及Connexin 43、心肌肌钙蛋白I等晚期标志物，并获得钙瞬变与收缩表型。心肌梗死后心包内注射miR-Combo可改善心功能，减少梗死区心肌细胞丢失，该过程依赖H3K27去甲基化介导的表观遗传重塑。与转录因子（Gata4、Mef2c、Tbx5）重编程仅适用于小鼠模型不同，miR-Combo在小鼠、猪、犬等多种哺乳动物模型中均有效，具备更高的临床转化潜力。综上，miR-1与miR-133是miR-Combo介导心脏重编程的关键组分，通过激活心脏转录程序与表观遗传重塑促进成纤维细胞向心肌样细胞转化，其跨物种有效性支持其作为再生治疗的候选方案，但重编程效率、细胞成熟度、靶向递送及长期安全性仍需系统评估。
5. Role of miR-1 and miR-133 in Adult Cardiac Homeostasis and Heart Failure
5.1. Myocardial Infarction and Cardiac Hypertrophy
心力衰竭（HF）是以心室功能受损为特征的进行性综合征，全球患者超5500万，发病率持续上升。HF常伴随心肌细胞凋亡、心肌重构、心肌肥厚、间质纤维化、炎症激活及心律失常等病理过程。miR-1与miR-133在HF中发挥保护性作用，其在人类、大鼠及小鼠梗死心肌组织中均显著下调；其中miR-133在梗死区与周边区均被抑制，miR-1仅在梗死区下调，提示二者在坏死与存活心肌的互作中具有功能特异性。多种心肌肥厚模型（甲状腺激素诱导、主动脉缩窄、异丙肾上腺素及血管紧张素II处理）均显示miR-1与miR-133下调，提示其受促肥厚信号负调控。功能实验证实，二者通过抑制钙信号通路拮抗心肌肥厚：miR-133a靶向抑制钙调磷酸酶（CaN），阻断其下游核因子活化T细胞3（NFATc3）核转位及MAPK信号激活；miR-1直接抑制NFATc3翻译，并靶向线粒体钙单向转运体（MCU），调控线粒体钙稳态；miR-133a还抑制蛋白激酶C（PKC）、NFATc4及血管紧张素II受体1型（AT1R），调控肌质网钙处理。此外，miR-1通过靶向Twinfilin-1（Tw1）抑制细胞骨架重塑，并通过抑制组蛋白去乙酰化酶4（Hdac4）调控促肥厚表观遗传环境。综上，miR-1与miR-133通过靶向钙信号、细胞骨架与表观遗传通路，构成协同抗肥厚调控网络。
5.2. Cardiac Fibrosis
miR-133a是心脏纤维化的核心负调控因子，其过表达通过抑制Erk1/2-Smad2磷酸化阻断心肌损伤后的纤维化进程；而Srf及其共激活因子Mrtf-A过表达则导致miR-133a下调，伴随纤维化标志物（纤连蛋白、I型/III型前胶原、结缔组织生长因子CTGF）上调。miR-133a可直接靶向CTGF 3'UTR诱导其降解，并在糖尿病纤维化模型中抑制Tgfβ翻译，阻断其下游促纤维化效应。目前尚未证实miR-1具有等效抗纤维化功能。miR-133a与MRTF-A/SRF通路的负反馈调控，使其成为抑制心肌纤维化、维持成纤维细胞稳态的潜在靶点。
5.3. Angiogenesis
miR-133a在血管系统中发挥细胞类型依赖的调控作用：在内皮细胞中，其通过靶向血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）与成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）抑制增殖、存活与迁移，阻断血管生成；在血管平滑肌细胞（VSMC）中，miR-133a维持细胞静息状态，血管损伤后其表达下调，导致Sp1与Srf上调，促进VSMC增殖与平滑肌基因程序激活。miR-1的血管调控作用尚待明确。
5.4. Inflammation
miR-1与miR-133a的炎症调控作用具有环境依赖性：炎症型心肌病患者心肌活检显示miR-133a上调伴随巨噬细胞浸润，提示其可能促进心肌炎症；而miR-1可通过靶向超极化激活环核苷酸门控通道2/4（HCN2/HCN4）轴，抑制TNF-α与IL-6分泌，发挥抗炎与心功能保护作用。二者在炎症中的具体机制仍需进一步验证。
5.5. Arrhythmogenesis
miR-1与miR-133a是剂量依赖的心脏电活动调控因子。miR-1-2敲除小鼠因Irx5上调抑制Kv4.2表达，导致心室复极化梯度异常与心律失常；持续性房颤患者左心房miR-1-2下调，导致Kcnj2（编码Kir2.1）上调，动作电位时程缩短，促进房颤维持。反之，miR-1过表达则下调缝隙连接蛋白43（Cx43）与Kir2.1，导致传导减慢、复极化延长，诱发室性心律失常；其还通过靶向PP2A调节亚基B56α，导致Ryanodine受体2（RyR2）过度磷酸化，钙处理异常，并通过抑制Stx6干扰离子通道转运，形成致心律失常基质。LNA修饰的抗miR-1可逆转实验性房室传导阻滞，miR-1有望成为房颤循环标志物。miR-133a在房颤患者中表达下调，Zfhx3功能缺失导致的房颤风险与miR-133a/b下调相关，补充miR-133a可逆转房颤表型；但miR-133a过表达可导致QT间期延长，通过靶向蛋白磷酸酶2（PP2A）与钾通道互作蛋白2（Kcnip2）调控钙、钾电流，提示其剂量需严格把控。综上，miR-1与miR-133a的缺乏或过表达均可致心律失常，其治疗应用需严格考量疾病类型、心脏腔室、剂量及电生理安全性。
6. Clinical Translation: Inconsistent Clinical Signals, Delivery, Biomarkers and Safety
临床研究中miR-1与miR-133a的表达变化具有组织与疾病阶段依赖性：二者在梗死心肌中下调，但在急性损伤后循环中因心肌细胞释放而升高；miR-133a在部分房颤队列中下调，却在炎症型心肌病与脓毒症中上调。这些差异源于样本来源、疾病病因、分期、炎症状态、用药及检测方法等混杂因素。生物标志物开发需依托多中心、纵向队列，标准化样本采集、RNA提取、溶血评估与数据归一化，区分miR-1-1-3p与miR-133a-3p，结合临床指标构建多标志物panel，而非单一阈值。治疗递送需根据调控需求选择miRNA模拟物或抗miRNA寡核苷酸，优先采用局部或细胞靶向递送系统（如心肌内注射miR-Combo、RGD-PEG-PLA纳米颗粒递送miR-133、LNA修饰抗miR-1），以降低全身暴露风险。安全性是核心限制：miR-1与miR-133a调控多靶基因，剂量异常可影响骨骼肌、平滑肌、内皮及免疫细胞，并致电生理紊乱；需系统评估剂量反应、生物分布、免疫激活、肝肾毒性、致瘤性及电生理安全性，优先采用细胞选择性、短疗程、序列优化策略。近期转化重点应聚焦于疾病特异性生物标志物panel与局部递送的短期干预方案，明确分子表达方向、靶细胞区室与治疗窗口。
7. Integrated Synergistic and Antagonistic Actions of miR-1 and miR-133
miR-1与miR-133的生物学关系兼具协同与拮抗特征。双顺反子结构保障二者转录同步，但种子序列差异使其靶向不同网络：在胚胎发育中，双敲除表型重于单敲除，通过协同抑制Myocardin与平滑肌程序维持心肌身份；在肥厚心脏中，二者通过不同靶点协同抑制钙、MAPK、细胞骨架与表观遗传通路。拮抗作用则体现在表型层面：在ESC分化中，miR-1促进心肌分化，miR-133维持前体未分化状态；在禽类后心脏区域，二者通过反向调控RA信号影响增殖与成熟。其功能关系取决于剂量、发育阶段、细胞类型与生物学终点，需通过双miRNA扰动、单细胞/空间组学及多组学靶标图谱，定量解析其加和、协同与拮抗效应，避免将共表达等同于功能等效。
8. Conclusions and Future Perspectives
miR-1/miR-133簇是调控心脏发生与心血管稳态的核心转录后调控网络，其表达异常参与心力衰竭的多种病理进程。二者虽常作为独立分子研究，但作为整合调控网络的组分，其协同与拮抗功能共同精细调控心脏发育与疾病进展。未来研究需聚焦miR-1的潜在核功能、物种间表达差异的进化机制，以及非经典调控通路；转化研究需突破靶向递送、剂量优化与安全性瓶颈，并验证其作为生物标志物与再生治疗靶点的临床价值。单细胞多组学技术与非编码RNA互作网络解析，将进一步揭示该簇的调控全景，推动心血管疾病机制研究与创新治疗策略开发。
