在ND7/23细胞中，缺陷性的铁蛋白吞噬作用参与了高葡萄糖引起的神经元氧化损伤

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Defective ferritinophagy was involved in high glucose-induced neuron oxidative damage in ND7/23 cells

　　

摘要

糖尿病周围神经病变与高血糖引起的氧化应激有关。铁蛋白吞噬对于维持细胞内铁平衡以及防止铁过载引发的氧化损伤至关重要。然而，铁蛋白吞噬与高血糖导致的神经元氧化损伤之间的关系尚未得到研究。在本研究中，我们建立了ND7/23细胞高血糖诱导氧化损伤的模型。通过使用雷帕霉素或巴afilomycin A1处理ND7/23细胞来观察铁蛋白吞噬的变化，同时利用转染NCOA4-siRNA的细胞来探讨铁蛋白吞噬在这一过程中的作用。研究结果表明，高血糖会降低ND7/23细胞的存活率，增加细胞内铁过载和活性氧积累，并引发异常的铁蛋白吞噬现象，表现为铁蛋白、NCOA4和p62蛋白水平升高，而LC3II/I比率下降。雷帕霉素激活铁蛋白吞噬可缓解高血糖引起的ND7/23细胞铁过载和氧化损伤，而巴afilomycin A1抑制自噬则会加剧这些高血糖介导的损伤。有趣的是，我们发现敲低NCOA4能改善高血糖导致的铁蛋白吞噬障碍，降低细胞内铁浓度，并减轻高血糖处理下ND7/23细胞的氧化损伤。综上所述，高血糖会抑制铁蛋白吞噬，打破铁平衡，从而导致ND7/23细胞内铁积累及神经元氧化应激损伤。我们的研究结果可能为预防和治疗高血糖诱导的氧化损伤提供新的思路和潜在策略。

引言

近几十年来，全球糖尿病的患病率持续上升。2021年糖尿病患病人数约为5.366亿，到2045年这一数字将上升至7.832亿[1]。糖尿病周围神经病变是糖尿病最常见的慢性并发症之一，其表现为疼痛、感觉异常、感觉丧失，是导致非创伤性残疾的重要原因[2][3]。据估计，糖尿病患者中DPN的全球患病率约为30%，而在糖尿病前期人群中这一比例则在6%到51%之间[4]。由于该病会导致较高的发病率和死亡率，约50%的患者生活质量受到严重影响[3]。先前的研究已经表明，DPN与氧化应激有关[2][5][6]，而氧化应激与糖尿病相关的神经和血管功能障碍的发病机制有着密切关联[3]。作为糖尿病患者中最常见且最严重的代谢紊乱之一，高血糖可通过多种途径引发氧化应激，包括氧化还原状态失衡、醛糖还原酶活性增强[7]、晚期糖基化终产物增多[8]、蛋白激酶C活性改变（尤其是β亚型）[9]以及前列腺素失衡[10][11]。此外，高血糖还会导致线粒体超氧化物过度生成[12][13]，进而引发神经元氧化损伤[14]。越来越多的证据表明，氧化应激[15]、神经元凋亡[16]以及线粒体膜超极化[17]都与高血糖引起的神经毒性有关。同时，慢性高血糖、氧化应激与DPN发展之间的潜在机制已在动物模型中得到验证[18]，这些机制主要与神经元凋亡有关[19]。

自噬通过保护细胞免受各种压力和损伤来维持细胞平衡[20][21]。铁蛋白吞噬是一种选择性的自噬形式，它由核受体共激活因子4（NCOA4）介导，这种特殊的货物受体能够直接识别并结合铁蛋白重链多肽1（FTH1），将其送入自溶体中进行降解，随后释放出游离铁[22]。值得注意的是，糖尿病常常伴随着铁过载现象，过多的铁会在胰腺β细胞和肝细胞中积累，从而引发氧化应激，降低胰岛素分泌，进而导致胰岛素抵抗[23]。溶酶体可以降解许多大分子，其中包括那些在铁平衡被破坏时容易受到氧化应激影响的含铁分子[24]。先前的研究表明，高血糖可引发依赖铁的脂质过氧化，进而导致细胞死亡[25]。铁平衡失调会导致细胞内铁过载，通过芬顿反应产生活性氧，促使脂质过氧化物质积累，最终导致细胞死亡[26][27]。我们之前的研究已经证实，db/db小鼠存在线粒体自噬功能障碍，这会导致活性氧生成增加以及神经元氧化损伤[28]。然而，铁蛋白吞噬与高血糖诱导的神经元氧化损伤之间的潜在关系尚不清楚，也尚未得到研究。

在本研究中，我们建立了ND7/23细胞高血糖诱导氧化损伤的模型，并研究了高血糖处理下ND7/23细胞中铁蛋白吞噬的变化。此外，我们还利用转染NCOA4-siRNA的ND7/23细胞来探讨铁蛋白吞噬在高血糖诱导氧化损伤中的作用，这一研究可能为高血糖引起的神经元氧化损伤提供新的见解和潜在的治疗靶点。

章节节选

细胞模型与高血糖处理

ND7/23细胞[29]（一种由小鼠神经母细胞瘤N18tg2细胞和大鼠背根神经节神经元构成的杂交细胞系）在含有89%杜尔贝克改良伊格尔培养基、10%胎牛血清以及1% Glutamax的培养基中培养，培养环境为温度37℃、二氧化碳浓度5%的细胞培养箱。为了建立高血糖诱导的神经元损伤模型，这些细胞被分别用不同浓度的葡萄糖（25 mM、50 mM、100 mM）进行处理。等摩尔的甘露醇被用作渗透压对照，以避免非特异性影响

高血糖对ND7/23细胞中铁蛋白吞噬相关蛋白的影响

我们将ND7/23细胞分别用25 mM、50 mM和100 mM浓度的高血糖处理，以研究高血糖对其存活率的影响。如图1A所示，与对照组相比，25 mM、50 mM和100 mM高血糖处理组的细胞存活率均显著下降（P<0.05）。如图1B所示，我们还绘制了细胞抑制率曲线，结果显示其IC50值为38.87 mM。因此，我们选择50 mM浓度的高血糖处理细胞，时间分别为24小时、48小时和72小时。如

讨论

本研究旨在探究是否存在铁蛋白吞噬功能缺陷在高血糖诱导的神经元氧化损伤中的作用。本研究的主要结果如下：（1）高血糖会影响ND7/23细胞的铁蛋白吞噬功能，同时导致细胞内铁过载和氧化损伤加剧。（2）雷帕霉素可恢复铁蛋白吞噬功能，从而减轻高血糖引起的ND7/23细胞铁过载和氧化损伤。（3）抑制自噬则

结论

总之，我们的研究表明高血糖会抑制铁蛋白吞噬功能，进而导致潜在的铁缺乏以及代偿性的铁吸收，最终引起ND7/23细胞内的铁过载和氧化损伤。激活铁蛋白吞噬功能可减轻这类有害损伤，而抑制自噬则会加重细胞损伤。这些结果为寻找治疗高血糖诱导的神经元损伤的潜在靶点提供了新的机制依据。

CRediT作者贡献说明

季中华：文章撰写——审阅与编辑、项目管理、实验研究。刘忠杰：文章撰写——审阅与编辑、实验研究、数据分析。范可可：文章撰写——初稿撰写、方法设计、数据整理

伦理声明

无需特殊伦理声明。

利益冲突声明

作者们声明不存在任何利益冲突。

资金支持

本研究得到了中国国家自然科学基金的支持（项目编号：82171204）。

利益冲突声明

作者们声明不存在任何利益冲突。

致谢

无

范可可|季中华|刘忠杰

广东省汕头市医学院附属深圳儿童医院麻醉科，中国广东省深圳市益田路7019号，邮编518026