《Biochemistry and Biophysics Reports》：Virus-like particles vaccine of porcine epidemic diarrhea virus spike 1 protein induces protective immunity challenge in piglets
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猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高度传染性肠道疾病，损害仔猪生长发育，造成重大经济损失。因此，开发有效疫苗对于预防和控制PEDV至关重要。本研究利用真核表达系统，通过SpyTag-SpyCatcher将S1与铁蛋白（Ferritin）组装成病毒样颗粒（S1–
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种高度传染性肠道疾病，损害仔猪生长发育，造成重大经济损失。因此，开发有效疫苗对于预防和控制PEDV至关重要。本研究利用真核表达系统，通过SpyTag-SpyCatcher将S1与铁蛋白（Ferritin）组装成病毒样颗粒（S1–F-VLP），并确认其免疫原性和保护效力。结果显示，在S1–F-VLP疫苗接种期间未出现小鼠死亡或母猪流产，证实其安全性。在小鼠、母猪和仔猪模型中，S1–F-VLP疫苗接种诱导了高水平的PEDV特异性抗体，包括血清IgG、IgA（IgA）和中和抗体（NAbs）。仔猪攻毒试验结果显示，与对照组相比，S1–F-VLP疫苗接种仔猪的腹泻评分和肠道病毒载量显著降低，并且肠道病理损伤明显减轻。这些结果表明，S1–F-VLP对高毒力PEDV毒株赋予强大的免疫保护，并有望成为临床候选疫苗。
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的高度传染性肠道疾病，感染仔猪后死亡率接近100%，给全球养猪业造成重大经济损失。PEDV属于冠状病毒科α冠状病毒属，其刺突蛋白（S蛋白）是主要抗原，但S蛋白的正确表达和糖基化是重组亚单位疫苗开发的难点。目前使用的灭活疫苗和减毒活疫苗分别存在免疫原性不足和毒力回复风险，因此亟需开发兼具高安全性和强免疫原性的新型疫苗。研究人员基于S蛋白的S1亚基（N端核心抗原区域）和铁蛋白（Ferritin）的自组装特性，利用SpyTag-SpyCatcher共价偶联技术构建病毒样颗粒（VLP）疫苗，旨在增强免疫应答。该研究验证了S1–F-VLP疫苗在动物模型中的安全性和保护效力，为PEDV临床候选疫苗提供了依据。论文发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1）真核表达系统（HEK293细胞）表达糖基化S1蛋白（SpyTag-S1）；2）原核表达系统（大肠杆菌BL21）表达SpyCatcher-Ferritin融合蛋白；3）SpyTag-SpyCatcher自发共价偶联技术体外组装病毒样颗粒（S1–F-VLP）；4）免疫评价：ELISA检测PEDV特异性IgG和IgA，中和试验检测中和抗体（NAbs）；5）攻毒保护试验：使用PEDV强毒株（JS/SJ-2022，106 TCID50/mL）口服接种5日龄仔猪，监测临床症状、病毒载量（RT-qPCR）和病理组织学。动物模型包括BALB/c小鼠、怀孕母猪（来源为Jinyu Baoling公司）及所产仔猪。
**研究结果**
**SpyTag-S1可高效偶联至SpyCatcher-Ferritin**
通过SDS-PAGE验证，当SpyCatcher-Ferritin与SpyTag-S1摩尔比为1:2时，几乎全部游离S1被消耗，表明高效共价偶联。SEC-HPLC分析显示偶联产物洗脱时间早于游离S1，提示形成高分子量复合物。扫描电镜（SEM）观察到均匀分布的球形颗粒，证实成功自组装为病毒样颗粒。
**S1–F-VLP疫苗在小鼠中诱导PEDV特异性抗体**
ELISA检测显示，初次免疫后2周，S1和S1–F-VLP疫苗均诱导可检测的PEDV特异性IgG和IgA；加强免疫后2–4周，血清抗体滴度显著升高，且S1–F-VLP组高于S1组。中和试验结果类似，S1–F-VLP组血清中和抗体滴度显著高于S1组。小鼠空肠组织中PEDV特异性IgG和IgA抗体滴度也呈相同趋势。
**S1–F-VLP疫苗在母猪中诱导强免疫应答**
在怀孕母猪免疫期间未观察到厌食、腹泻、流产、死亡或注射部位脓肿等临床症状。ELISA结果显示，S1和S1–F-VLP疫苗均诱导母猪血清和初乳中高水平的PEDV特异性IgG、IgA和中和抗体，且S1–F-VLP组抗体滴度显著更高。
**S1–F-VLP保护仔猪抵抗PEDV**
攻毒试验中，S1–F-VLP组仔猪血清和空肠组织中PEDV特异性IgG、IgA和中和抗体（滴度≥1:256）均显著高于S1组。RT-qPCR检测显示，S1–F-VLP组仔猪粪便病毒载量显著低于对照组和S1组。临床观察表明，S1–F-VLP组仔猪仅出现轻微腹泻并迅速恢复，而对照组出现严重水样腹泻、肠道水肿和出血。病理组织学检查显示，S1–F-VLP组仔猪空肠黏膜结构完整，绒毛形态保存，而对照组出现绒毛顶端细胞脱落和固有层坏死。
**讨论与结论**
讨论部分指出，PEDV难以根除，传统疫苗保护效果有限，而基于S1亚基和铁蛋白自组装的VLP策略具有高安全性和强免疫原性优势。本研究通过SpyTag-SpyCatcher技术成功组装S1–F-VLP，并在小鼠、母猪和仔猪模型中证实其诱导高水平中和抗体并有效保护仔猪。结论部分（翻译）：总之，研究人员优化了PEDV-S1和铁蛋白的氨基酸序列，利用SpyTag-SpyCatcher技术进行抗原重组，并组装成优化的重组载体，从而成功获得SpyTag-S1和SpyCatcher-Ferritin蛋白。HPLC和SEM分析结果均证实两种组分成功组装成纳米颗粒。临床试验结果表明，将S1–F-VLP与ISA206佐剂配制的疫苗可诱导高滴度中和抗体，有效保护仔猪免受PEDV感染。上述结果表明，S1–F-VLP重组亚单位疫苗具有强安全性、高免疫原性和高保护率，表明其作为PEDV候选疫苗的潜力。这些发现也为其他亚单位疫苗开发的临床应用奠定了基础。
