《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Topological mapping establishes signal peptide-independent cytoplasmic membrane insertion of bacterial MATE family efflux protein EmmdR
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•本文首次通过实验验证了EmmdR预测的二维拓扑结构。•EmmdR包含12个跨膜结构域，其N端和C端均位于细胞质侧。•EmmdR的膜定位遵循“正内规则”来确定其拓扑结构。•本研究为EmmdR在细胞质膜上的定位及其拓扑结构提供了实验依据，该蛋白被预测存在于Uniprot数据库中。引
• 本文首次通过实验验证了EmmdR预测的二维拓扑结构。
• EmmdR包含12个跨膜结构域，其N端和C端均位于细胞质侧。
• EmmdR的膜定位遵循“正内规则”来确定其拓扑结构。
• 本研究为EmmdR在细胞质膜上的定位及其拓扑结构提供了实验依据，该蛋白被预测存在于Uniprot数据库中。
引言 肠杆菌属 属于ESKAPE病原体群体，这类病原体已快速演化出对多种抗生素的耐药性。肠杆菌属 与下呼吸道感染、尿路感染、菌血症、腹腔内感染、皮肤及软组织感染、眼部感染、心内膜炎、骨髓炎以及化脓性关节炎等相关[1]、[2]。肠杆菌属 能自身产生低水平的Bush 1组（C类）诱导型头孢菌素酶，这类酶可使其对氨苄西林、阿莫西林-克拉维酸、头孢噻丁以及头孢氧西丁产生耐药性[3]。更糟糕的是，肠杆菌属 的基因组还编码属于RND、MATE、MFS和SMR家族的多种外排系统，这些系统可使细菌对四环素、氟喹诺酮类以及氨基糖苷类等多种抗菌药物产生耐药性。外排泵蛋白要么是贯穿细菌细胞膜的多组分系统，要么是将底物从细胞质转运到周质的单组分内膜蛋白。MATE、MFS和SMR外排蛋白属于后者。细菌的MATE蛋白在赋予细菌对多种底物的耐药性方面起着关键作用，这些底物包括阳离子染料、氨基糖苷类以及氟喹诺酮类[4]、[5]。
由肠杆菌属 基因组编码的外排蛋白EmmdR属于多药/毒素化合物外排（MATE）转运蛋白家族（转运蛋白分类编号2.A.66.1）。MATE家族的外排蛋白隶属于多药/寡糖-脂质/多糖（MOP，TCID 2.A.66）超家族。MATE家族的外排泵广泛存在，在真核生物和原核生物中都发现了众多同源基因[4]、[5]、[6]。MATE转运蛋白通常由约450–550个氨基酸残基组成，其独特结构特征为具有12个跨膜螺旋，这些螺旋分为N端和C端两个区域，每个区域各包含6个跨膜螺旋[5]、[7]。MATE转运蛋白的一个显著特点是其分子内的双重对称性，这种对称性以垂直于细胞膜平面的轴为中心。这种独特的结构安排对其转运功能起着至关重要的作用[6]、[8]、[9]。这类转运蛋白作为次级主动转运蛋白，利用H+ /Na+ 电化学梯度所提供的能量[7]、[8]来推动底物的外排。细菌中这一家族的知名成员包括NorM、DinF、YdhE、Vmr、PmpM、MepA、AbeM、HmrM、CdeM、BexA以及Vcm[10]。
EmmdR（Uniprot编号A0A0H3CLV5）是MATE家族中研究相对较少的成员，它最早于2011年在肠杆菌属 ATCC13047菌株中被发现，该基因位于ECL_03329位置[11]。EmmdR的缺失突变体对溴化乙锭、诺氟沙星、环丙沙星以及磺胺甲噁唑的敏感性有所增加[11]。尽管该蛋白的功能已被阐明，但其拓扑结构以及其在膜中的插入方式仍有待确定。本研究旨在通过实验验证EmmdR的计算机预测拓扑结构，并探究其N端和C端在蛋白膜插入过程中的作用。
章节摘要 系统发育分析 为确定EmmdR的亲缘关系，研究者构建了系统发育树。该蛋白由462个氨基酸组成，研究中使用了从NCBI数据库中获取的41种细菌MATE家族蛋白的氨基酸序列。系统发育树是通过MEGA 11软件的基于根的邻接距离法构建的，为提高准确性，共进行了1000次自举重复计算。从MEGA 11导出的Newick格式文件被上传至iTOL v7服务器（
https://itol.embl.de/ ）
系统发育分析显示EmmdR与YeeO细菌MATE转运蛋白同属一类 为了解EmmdR与那些已被充分研究的MATE家族蛋白之间的亲缘关系，研究者对包括EmmdR在内的MATE家族转运蛋白进行了系统发育分析。分析结果如图1A所示。分析结果表明，EmmdR与YeeO同属一类，其自举值达1（100%）。细菌的MATE蛋白可明确划分为三个主要类别：NorM、DinF和VcmD，而YeeO、Aq_128以及EmmdR则形成了另一个分支，不过
结论 本研究验证了这种较为罕见的MATE家族外排蛋白EmmdR的预测拓扑结构及其膜定位方式。研究结果支持CCTOP程序预测的EmmdR含有12个跨膜结构域的结论，同时也证实了其N端和C端均位于细胞质中（见图4）。作为一种多结构域蛋白，EmmdR的蛋白序列中包含有关其膜插入方式的信息。本研究的结论与“正内规则”具有高度一致性，这一规则可用来解释
研究意义 这是首项为EmmdR预测的二维拓扑结构提供实验验证的研究，同时证实了“正内规则”对其膜插入过程的调控作用。本研究为EmmdR在细胞质膜上的定位及其拓扑结构提供了实验依据，而该蛋白确实被预测存在于Uniprot数据库中。
CRediT作者贡献说明 Hitkarsh Kushwaha： 负责撰写初稿、开展实验研究。Jiban Mishra： 负责文本审阅与编辑、数据可视化、验证工作、方法设计、实验研究、正式分析以及数据整理。Harapriya Mohapatra： 负责文本审阅与编辑、项目监督、资源协调、项目管理、方法设计、资金申请、正式分析以及概念构思。
资金支持 本研究得到了原子能部 向布巴内斯瓦尔的国家科学教育与研究研究所提供的内部资金支持（UID：RIN4002）。
利益冲突声明 作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢 作者衷心感谢巴斯德研究所的Ladant教授和Karimova博士赠送的pKTop双报告载体。同时感谢R. Srinivasan博士分享的pDSW210载体，该载体最初来自爱荷华大学的David Weiss教授，此外还要感谢ABCD实验室的成员们在荧光显微镜成像过程中提供的技术协助。作者还感谢NISER生物科学学院提供的基础设施支持，HK特别感谢相关方的资金支持
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