综述：不同酰基链长度的鞘磷脂种类对质膜组织的影响

《Biochimie》：Impact of sphingomyelin species with different acyl chain lengths on plasma membrane organization

　　

质膜（PM）以脂质头部基团的化学性质和脂质酰基链的物理性质两方面的不对称双层组织为特征。鞘磷脂（SM）是主要的外叶脂质，长期以来被认为是胆固醇（Chol）在形成有序膜结构域中的关键伙伴。然而，哺乳动物细胞含有多种具有不同N-酰基链的SM种类，最主要的是C_16:0、C_24:0和C_24:1，它们的结构差异可以改变膜堆积、Chol分布和叶间通讯。来自模型膜的证据表明，C_16:0 SM与Chol强烈相互作用并促进液体有序结构域的形成。相比之下，C_24:0 SM产生更厚的、可能插层（interdigitated）的双层，支持具有改变的Chol关联的有序结构域，并可能影响两个叶之间的耦合。C_24:1 SM将极长酰基链与不饱和性结合，减弱膜堆积并抑制含Chol膜中的宏观相分离。不对称囊泡研究进一步表明，C₂₄ SM可以影响Chol的跨叶分配，这可能对Chol的可及性和稳态信号传导产生影响。细胞研究进一步表明，重塑SM种类可以改变糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白的聚集、PM有序度、Chol结合探针的可及性以及信号蛋白如胰岛素受体。总之，当前证据支持一个模型，在该模型中，SM种类多样性通过耦合效应对脂质堆积、Chol行为、叶不对称性和蛋白质功能来调节PM组织。在活细胞中理解这些机制仍然是未来研究的重要问题。

1. 引言
质膜（PM）是哺乳动物细胞的最外层膜，具有与其他膜区室不同的特征性脂质组成。组成脂质在（细胞外）外叶和（细胞质）内叶之间不对称分布，形成叶之间的化学和物理不对称性。磷脂酰胆碱（PC）、鞘磷脂（SM）和糖脂主要存在于外叶，而磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）和磷酸肌醇（PIPs）通常存在于内叶。胆固醇（Chol）的跨叶分布仍存在争议。这种脂质类别不对称性由ATP依赖性脂质转运蛋白主动维持。PS和PIPs，特别是PI(4,5)P₂，产生带负电荷的表面，并作为信号脂质招募带有聚碱性基序和脂质结合结构域（如普列克底物蛋白同源（PH）结构域）的胞质蛋白。磷脂酰基链的饱和度在叶之间也是不对称的。外叶脂质倾向于具有饱和或单不饱和酰基链，而内叶脂质富含多不饱和酰基链。这种疏水部分的不对称性导致两个叶之间膜堆积状态的差异。因此，PM组织不仅受头部基团化学性质的不对称性影响，还受酰基链组成导致的物理性质不对称性影响。
除了不对称组织，外叶脂质被认为在侧向上是异质的，而非均匀分布。这种侧向异质性被认为至少部分源于Chol与SM相比与其他磷脂的优先相互作用。SM是一种主要鞘脂，约占PM磷脂的15 mol%，而Chol更为丰富，占PM总脂质的40 mol%。这种丰度差异意味着Chol不能仅与SM相互作用，还必须与其他磷脂结合。然而，在由SM、不饱和PC和Chol组成的模型膜中，SM和Chol形成紧密堆积的液体有序（Lo）结构域，这些结构域在生理温度下从不饱和PC富集的液体无序（Ld）结构域中分离出来。这种Lo结构域被广泛用作膜微结构域（也称为脂筏）的模型系统，脂筏被认为在信号转导、蛋白质分选和运输以及病原体感染中起平台作用。尽管在模型膜中观察到的Lo结构域是有用的实验模型，但应注意不要将Lo结构域与活细胞中发现的微结构域/脂筏等同起来，后者可能由多种不同的脂质和蛋白质组成。
在SM/Chol富集的有序结构域分离的背景下，SM被视为相对均匀的脂质类别，而细胞SM包含多种N-连接酰基链种类。在许多细胞类型中，SM通常呈现双峰N-连接酰基链分布，含有丰富的长链C₁₆ SM和极长链C₂₄ SM种类，包括C_24:0和C_24:1 SM。最近的脂质体实验揭示，Chol与具有不同酰基链长度和不饱和度的SM种类相互作用不同。这种SM-Chol相互作用的差异不仅可能影响侧向PM组织，还可能影响Chol在双层之间的分配。本迷你综述聚焦于SM N-酰基链长度和不饱和度如何影响SM-Chol相互作用、膜堆积、Chol分布，并最终影响PM组织。

2. 细胞和组织中的SM N-酰基链多样性
SM由三个结构元素组成：鞘氨醇碱基、通过酰胺键连接的N-连接脂肪酸，以及连接在鞘氨醇碱基C1上的磷酸胆碱头部基团。最常见的鞘氨醇碱基是鞘氨醇（d18:1），它在C4处含有一个反式双键，尽管其他种类也以细胞/组织依赖性方式存在。脂质组学分析检测到从C₁₄到C₂₆的N-酰基链。在天然存在的SM中，最常见的单不饱和极长链种类通常是C_24:1 SM，它在Δ15（n-9）处含有一个顺式双键（C_24:1cisΔ15 SM；在本迷你综述中，该种类称为C_24:1 SM）。
由于鞘氨醇碱基通常为C₁₈，N-酰基链长度的变化在SM分子内产生链不对称性。在C_16:0 SM中，N-酰基链的长度与d18:1鞘氨醇相似，而在C₂₄ SM中，N-酰基链要长得多。这种分子内链长不匹配被认为影响与相邻脂质的堆积以及与对侧叶脂质的相互作用。
这里总结了不同细胞类型和组织中脂质组学研究报告的SM N-酰基链组成。由于PM含有大部分细胞SM，总细胞SM组成可能提供PM可用SM种类的有用近似。然而，这些数据不应被解释为PM SM组成的直接测量。在许多细胞类型和组织中，C_16:0 SM、C_24:0 SM和C_24:1 SM是最丰富的种类之一，共同常占SM总种类的50-90%，而其他种类以较少量或痕量存在。在一些组织中，如脑，C_18:0 SM和C_24:1 SM被报告为主要种类。如表所示，尽管C_16:0 SM在大多数情况下是主要种类，但在一些培养细胞系中，如HeLa、Cos-7、Raw 264.7、MEF和HepG2细胞，C₂₄种类（C_24:0 SM和C_24:1 SM）比C_16:0 SM更丰富。

3. 机制基础：SM酰基链如何重组PM
以下部分考虑SM酰基链多样性如何在多个水平上影响PM组织。首先，单个SM种类在内在物理性质上存在差异，包括堆积、相行为和插层潜力。其次，这些性质改变对称模型膜中的Chol关联和有序结构域形成。第三，多种SM种类的混合物可以产生异质有序结构域。最后，不对称模型膜揭示极长链SM可能影响叶间耦合和Chol跨叶分布。

3.1. 纯SM种类膜的物理性质
C_16:0 SM、C_24:0 SM和C_24:1 SM的结构特征彼此显著不同，使得这种组合成为PM中独特的库。C_16:0酰基链的长度与d18:1鞘氨醇相当，而极长的C₂₄酰基链与d18:1鞘氨醇碱基产生大的链长不匹配。C_24:1 SM极长酰基链中顺式双键的存在使该分子在大多数饱和的SM种类中独一无二。为了理解这些种类如何促成膜组织，研究了它们的物理特性。单个SM种类的热致性性质是关键因素，反映了它们在膜中的行为。SM的凝胶到液晶相转变温度（T_m）已通过差示扫描量热法（DSC）和1,6-二苯基-1,3,5-己三烯（DPH）各向异性测量等技术确定。C_16:0 SM、C_24:0 SM和C_24:1 SM的主要T_m分别为41°C、约46°C和24°C。SM双层的热致性稳定性反映了分子间范德华相互作用和氢键相互作用之间的平衡，两者都受烃链堆积的影响。因此，T_m通常随N-酰基链长度增加而增加，随N-酰基链不饱和度增加而降低，与其他磷脂的情况类似。C_16:0 SM的DSC吸热曲线显示单一对称峰，表明双层处于均匀状态。对于C_18:0 SM和C_24:0 SM，N-酰基链与鞘氨醇之间的长度不匹配更大，观察到具有多个转变的更复杂的热致性行为。其中两个被提出代表具有不同程度部分插层的两种不同凝胶相。X射线散射数据中C_20:0 SM、C_22:0 SM和C_24:0 SM的电子密度分布也表明链插层。插层是较长的酰基链穿透对侧叶并与该叶中的烃链相互作用的现象。因此，C₂₄ SM等极长链SM分子的一个独特特征是它们跨双层插层的潜力，这在PM中可能相关。
突破力（F_b）是双层破裂前可施加的最大力，因此代表膜的刚度和堆积程度。使用原子力显微镜（AFM）测量。由C_16:0 SM、C_24:0 SM或C_24:1 SM组成的支撑平面双层（SPB）的平均F_b据报道分别为36.8 nN、32.0 nN或30.6 nN。测量了C_16:0 SM和C_24:1 SM单层的表面压力-面积（π-A）等温线，以了解这些单层的紧密堆积程度。结果显示C_16:0 SM和C_24:1 SM分别在62 ± 2 mN/m和50.0 ± 0.6 mN/m处崩塌，并且在整个等温线中C_24:1 SM的平均分子面积（MMA）值大于C_16:0 SM。这反映了C_24:1 SM膜的侧向堆积密度显著低于C_16:0 SM膜，可能是由于酰基链中存在顺式双键。原子分子动力学（MD）模拟用于比较由不同酰基链的单个SM种类组成的双层膜的结构和动力学性质。增加酰基链长度降低了每个脂质的平均面积，增加了双层厚度和插层深度，在C₁₆到C₂₄的饱和和单不饱和SM双层中均如此。此外，增加酰基链长度降低了侧向扩散速率。酰基链中顺式双键的引入降低了旋转速率和脂质堆积。
总之，这些研究表明C_16:0 SM有利于紧密、相对对称的堆积；C_24:0 SM有利于更厚且可能插层的双层；C_24:1 SM将极长链特征与不饱和性引起的局部无序相结合。这些内在差异可能构成了它们在混合膜中与Chol不同相互作用的基础。

3.2. 含Chol的对称脂质双层中SM种类的行为
鉴于上述结构差异，几项研究检查了单个SM种类在模型膜中如何与Chol相互作用。这很重要，因为Chol优先与饱和磷脂（包括SM）结合，并在三元SM/不饱和PC/Chol对称膜中驱动有序结构域形成。
Chol与不同酰基链长度的SM种类之间的相互作用通过热致性和荧光测定法监测。通过测定荧光Chol类似物胆甾三烯醇（CTL）在甲基-β-环糊精（MβCD）和POPC/SM（4:1摩尔比）大单层囊泡（LUV）之间的平衡分配，检查了Chol对饱和N-酰基链SM种类的亲和力。与许多其他Chol类似物相比，CTL的行为与Chol非常相似。所有测试的SM种类均增加了CTL向SM/POPC（1-棕榈酰-2-油酰PC，C_16:0-18:1 PC）双层的分配，相比于POPC双层。CTL在含有C_16:0 SM的双层中表现出最高的亲和力。在由SM/POPC/Chol（60:30:10摩尔比）组成的双层中，通过使用CTL和反式-对壬酸（tPA）的荧光技术检查了有序结构域的热稳定性。tPA被用作Lo结构域的标记。有序结构域的热稳定性和Chol与SM的相互作用通过tPA和CTL的荧光猝灭反映，这是由于随着温度升高，它们分配到含有猝灭剂1-棕榈酰-2-硬脂酰-(7-氧基)PC（7SLPC）的无序结构域中。结果表明，C_24:0 SM形成有序结构域，尽管比C_16:0 SM含有更少的Chol，而C_24:1 SM似乎不形成有序结构域。
通过测量23°C下tPA的荧光寿命，检查了在不存在或存在20 mol% Chol的情况下SM种类与PC的混溶性。由于tPA在Lo相中的荧光寿命增加，寿命随SM浓度的变化表明SM在包含PC的Ld相中的溶解程度。在23°C到37°C的温度范围内，C_16:0 SM在POPC和PAPC（1-棕榈酰-2-花生四烯酰PC，C_16:0-20:4 PC）中的溶解度极限高于C_24:0 SM。添加Chol降低了C_16:0 SM在两种PC中的极限，但未改变或仅轻微改变了C_24:0 SM的极限。这些结果表明Chol通过与该种类形成有序结构域将C_16:0 SM从流体PC双层中分离出来。使用DPH和Rho-DOPE之间的FRET测量检查了SM/PC/Chol（40:40:20）三元混合物中凝胶结构域的热稳定性。在该测定中，Rho-DOPE优先分配到无序结构域，而DPH分布更广泛。当有序结构域大且分离良好时，两种探针在空间上分离，FRET降低。相反，更高的FRET表明更小或分离更差的有序结构域。使用该测定，C_16:0 SM形成最大的Lo结构域，C_24:0 SM产生较小的结构域，C_24:1 SM产生最弱的结构域分离。
总之，这些结果表明，在各种SM种类中，Chol优先与C_16:0 SM相互作用，而C_24:0 SM支持具有改变Chol关联的有序结构域，C_24:1 SM削弱了稳定的结构域分离。
不同SM种类的相行为也在共聚焦显微镜下由不饱和PC/SM/Chol组成的对称巨型单层囊泡（sGUV）中观察。含有C_16:0 SM和C_24:0 SM的sGUV显示Lo与Ld相的侧向分离，但含有C_24:1 SM的sGUV表现出Lo和Ld探针的非分离和均匀分布。在由DOPC（二油酰PC，di18:1 PC）/C_16:0、C_24:0或C_24:1 SM/Chol（2:1:1摩尔比）制备的SPB的AFM成像中观察到类似的相分离模式。相分离的Lo和Ld结构域在由C_16:0 SM或C_24:0 SM制备的双层中高度差为0.6-0.7 nm。与sGUV结果一致，在DOPC/C_24:1 SM/Chol双层中未观察到相分离。
AFM力谱测量报告了由C_16:0 SM和C_24:1 SM制成的双层的F_b值。在由C_16:0 SM/DOPC/Chol制备的相分离双层中，F_b呈现两个种群，平均值分别为5.7 nN和11.3 nN，对应Ld和Lo相。C_24:1 SM/DOPC/Chol的F_b显示一个单一种群，中间值为8.0 nN。另一项研究报道了类似趋势，其中C_16:0 SM双层中Lo结构域的F_b高于C_24:1双层，值分别为20.9 nN和10.7 nN。这些结果表明，含有C_24:1 SM的膜在机械上比C_16:0 SM膜中的Lo结构域抵抗力更弱，表明C_24:1 SM酰基链中的不饱和性削弱了膜堆积。
共聚焦显微镜、AFM形貌和力谱的结果表明，C_24:1 SM对DOPC/SM/Chol膜具有无序化效应，阻止相分离。使用Laurdan研究了C_24:1 SM对水-膜界面处膜性质的影响。Laurdan是一种溶剂化显色染料，在响应较不极性和较少水合环境时发射蓝移荧光，这是有序膜的特征。为了定量评估膜有序度，根据发射位移计算广义极化（GP）作为膜有序度的指标。较高的GP表示更有序的膜。发现对于Chol与C_16:0 SM和C_24:1 SM的二元等摩尔混合物，Laurdan GP值相当。两个GP均显著高于在DOPC/Chol混合物中观察到的值。这一结果可能由C_24:1 SM的极长酰基链和双键位置解释，该双键靠近鞘氨醇末端且远离水-脂质界面。因此，C_24:1 SM在二元混合物中可能仍支持水-脂质界面附近的局部Chol依赖性有序化，但这并未转化为三元DOPC/SM/Chol膜中稳定的侧向相分离。
使用偏振调制红外反射吸收光谱（PM-IRRAS）进一步研究了C_24:1 SM对有序结构域形成的抑制作用，在由DOPC/SM/Chol（2:1:1摩尔比）三元混合物制成的脂质单层中进行。与含有C_16:0 SM的单层相比，C_24:1 SM的顺式双键不仅在酰基链区域诱导构象无序，而且还在空气/水界面处诱导相邻PC极性区域的不同构象。这些效应被认为削弱了相邻分子之间的分子间相互作用，并在三元混合物中诱导无序。
由于Laurdan GP报告局部膜水合/有序度，而PM-IRRAS检测脂质基团的特定构象和取向变化，可以推断C_24:1 SM保留了相对有序的空气-水界面，同时破坏了协同链堆积和相邻脂质取向，导致均匀但中等有序的膜状态。

3.3. 模型膜中不同SM种类的混溶性
在PM中，外叶的多种SM种类是否独立形成不同的结构域？在由POPC/C_16:0 SM/C_24:0 SM/Chol（60:15:15:10）组成的模型膜中使用DSC研究了C₂₄ SM和C_16:0 SM的混溶性。C_16:0 SM与C_24:0 SM或C_24:1 SM等摩尔混合物的热分析图表明，尽管它们并非理想混合，但两种种类至少部分混合。
还使用tPA和CTL的荧光猝灭测定检查了混溶性对相同组成膜中侧向分离的影响。结果表明，C_16:0 SM和C_24:0 SM一起形成有序结构域，但这些结构域似乎容纳的固醇少于由C_16:0 SM单独形成的有序结构域。此外，荧光猝灭曲线显示两步过程，表明存在两种具有不同组成的有序结构域。C_24:1 SM不能像C_24:0 SM那样形成有序结构域。
还使用共聚焦显微镜和头部基团标记的荧光SM类似物，在由C_16:0 SM/22:0 SM/Chol/DOPC四元混合物制备的sGUV中评估了两种SM种类的混溶性。当两种不同饱和SM以不同比例混合时，次要种类似乎被排除在富含主要种类的Lo结构域之外。此外，荧光SM的Lo结构域分配和扩散测量以及SM混合物的DSC热分析图表明，混合异质SM会松弛其链堆积。
Guyomarc’h等人使用AFM研究了由不同酰基链SM（包括乳脂球）混合物制成的膜双层的形貌。乳SM（mSM）含有从C_16:0 SM到C_24:0 SM的各种酰基链种类。结构域高度测量显示，C_16:0 SM双层均匀平坦且厚度小于C_24:0 SM双层，而mSM和C_24:0 SM双层表现出两种具有不同高度的凝胶相。较厚的凝胶相可归因于混合插层的C_24:0 SM分子。较薄的相可归因于完全插层的C_24:0 SM和非插层的C_16:0 SM分子。有趣的是，在C_16:0 SM和C_24:0 SM等摩尔混合物双层中也发现了这两种凝胶相。
因此，不同的SM种类并非完全分离成独立的结构域；相反，它们可以在有序或类似Lo的结构域内部分混溶，而链长不匹配可能松弛堆积并在这些结构域内产生组成异质性。在PM中，如果存在有序结构域，它们不太可能由单一SM种类组成。它们的堆积状态可能取决于C_16:0 SM、C_24:0 SM和C_24:1 SM的局部组成。

3.4. 不对称模型膜中的SM种类
制备不对称脂质体的最新技术进展使得在更接近PM的条件下研究SM酰基链长度对相分离的影响成为可能。在对称系统中，相分离的Lo或Ld结构域在两个叶的相同位置对齐。这种对齐称为对齐结构域或结构域注册，是叶间耦合的一种表现。在PM中，尽管筏（或类似Lo）结构域下方内叶的物理性质研究甚少，但预期会形成与筏具有相似物理性质的结构域。这种叶间对齐在能量上可能有利，因为它减少了边界变形、线张力以及跨双层有序与无序区域之间的不利接触。在生物学上，它也可能为外叶聚集受体与内叶信号蛋白之间的通讯提供物理基础。C_24:0 SM是插层介导的叶间耦合的可能候选者。在该假设中，C_24:0 SM的极长酰基链穿透对侧叶并与该叶中的脂质酰基链相互作用，导致跨双层结构域耦合。

3.4.1. 极长链SM的叶间耦合
在不存在Chol的情况下，通过荧光相关光谱（FCS）测量不对称GUV（aGUV）中每个叶的荧光脂质侧向扩散，检查了猪脑SM（bSM）和mSM对侧叶膜有序度的影响。外叶bSM仅略微降低了由DOPC组成的内叶的脂质扩散。相反，外叶mSM或C_24:0 SM大大降低了相同组成内叶的脂质扩散。这些结果表明，较长的SM种类可以诱导脂质扩散的叶间耦合。令人惊讶的是，使用荧光探针的测定并未显示膜有序度的叶间耦合。该研究表明，在不存在Chol的情况下，极长链SM可以在机械上影响对侧叶，而不施加相同程度的脂质有序度。
另一项研究在含有37% Chol的情况下，在外叶使用eSM或mSM/DOPC、内叶使用DOPC制备的aGUV中观察相分离。在该研究中，通过分配系数K_p（定义为Lo结构域中荧光标记脂质的荧光强度与Ld结构域中荧光强度之比）评估每个叶中膜有序度的程度。在两种情况下，外叶SM都能诱导内叶形成有序结构域。然而，mSM在叶之间显示出相近的K_p值，而eSM在叶之间显示出不同的K_p值。这些结果表明，含有eSM和mSM的外叶诱导内叶形成具有不同物理性质的有序结构域。进一步的工作系统性地研究了aGUV的热稳定性，这些aGUV由DOPC/Chol组成的内叶和不同数量的bSM或mSM以及DOPC/Chol组成的外叶制成。外叶脂质诱导内叶有序结构域的能力随其酰基链长度和含量增加而增加。由于Chol甚至在不饱和PC膜中也能支持有序结构域形成，内叶中的Chol可能促进与外叶SM富集结构域耦合的内叶有序结构域形成。
AFM力谱用于表征含有C_16:0 SM的不对称支撑脂质双层（aSLB）。通过使用MβCD将C_16:0 SM掺入DOPC/Chol双层的外叶制备aSLB。AFM在SM掺入后可视化Lo结构域的形成，其F_b值与对称SLB中的值相当。力谱测量检测到aSLB中Lo相的两个破裂事件，与对称SLB中的一个事件形成对比，表明Lo结构域中的叶间耦合。这些结果表明，甚至较短的C_16:0 SM也可能在内叶存在Chol的情况下诱导叶间耦合。

3.4.2. C₂₄ SM与Chol跨叶分配
除了在插层介导的结构域耦合中的作用外，不对称模型膜的研究还揭示，C_24:0 SM对相分离具有与对称系统不同的独特效应。即，由C_24:0 SM/DOPC/Chol组成的sGUV表现出相分离，与先前研究一致。然而，在由DPPC/DOPC/Chol组成内叶、C₂₄ SM/DOPC/Chol组成外叶的aGUV中，C₂₄ SM未诱导相分离并保持均匀。此外，在外叶含有C₂₄或C₁₆ SM的不对称LUV（aLUV）中，通过使用MβCD监测供体aLUV中[³