进化酵母用于微生物-电催化系统的甲酸胁迫响应机制

《BioDesign Research》：Mechanisms of Formic Acid Stress Response in Evolved Yeast for Microbial-Electrocatalytic Systems

　　

集成电催化微生物系统为碳循环提供了一条可持续的途径。然而，甲酸副产物的胁迫严重阻碍了微生物的转化过程。在此，研究人员通过适应性实验室进化（ALE）和转录组学分析，揭示了酿酒酵母在乙醇培养过程中应对甲酸胁迫的适应机制。甲酸暴露系统性地下调了中心碳代谢，同时上调了乙醛支路以补充碳骨架。与此同时，细胞周期基因通过促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路被激活，并且增强了核糖体生物发生以支持胁迫响应的翻译过程。通过提高酿酒酵母的甲酸耐受性并研究其潜在机制，研究人员对酵母进行了工程化改造，使其能够利用乙醇生产3-羟基丙酸（3-HP）。最终，研究人员将上游电催化系统与下游生产3-HP的工程酵母相集成，实现了95.8 mg/L的滴度，这比初始菌株的滴度高出4倍。这项工作阐明了甲酸耐受性的分子基础，并为集成电催化微生物系统展示了一条可行的途径。

随着大气CO₂浓度的持续上升，将其转化为高附加值化学品的技术引起了广泛关注。CO₂还原反应（CO₂RR）虽具潜力，但单一过程常面临产物选择性低和析氢反应竞争等瓶颈。为此，研究人员提出了集成电催化微生物系统的概念，将电催化还原的高反应速率与微生物合成的高选择性相结合。在将CO₂电催化还原为乙醇的过程中，因电子转移不足以驱动碳-碳偶联，不可避免地会产生一碳副产物甲酸。甲酸的积累不仅造成碳源浪费，还会对微生物代谢产生毒性胁迫。酿酒酵母作为基因编辑的模式宿主，具有明确的遗传背景和成熟的代谢工程工具，并且在利用乙醇作为碳源时表现出极高的耐受性，能直接转化为关键中间体乙酰辅酶A且不额外消耗碳，符合碳保留的战略需求。然而，甲酸作为弱酸进入细胞后会解离释放H⁺和HCOOH^-，破坏胞内pH平衡并增加渗透压，导致细胞受损。为解决这一问题，研究人员探究了酿酒酵母在以乙醇为唯一碳源时应对极端甲酸胁迫的转录响应机制，并构建了CO₂电催化还原系统，将适应甲酸的工程酵母用于生产3-HP，在iEMS框架内实现了从CO₂到3-HP的完整转化，该论文发表在《BioDesign Research》上。

在关键技术方法方面，研究人员以山东大学Hou教授课题组提供的S. cerevisiae CEN.PK102-5B为出发菌株。主要采用了在含乙醇培养基中历经150天逐渐增加甲酸浓度的适应性实验室进化（ALE）技术以获取耐受突变株；利用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞表型变化；运用RNA-Seq转录组学测序分析基因表达谱；并通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证测序结果；此外，合成了CuO_x氧化铜纳米簇催化剂用于电催化还原CO₂，结合代谢工程手段在酵母中整合MCRca、ADH2和ALD6基因构建产3-HP的重组菌株。

甲酸耐受型酿酒酵母的适应性进化及胁迫下的细胞形态分析
研究人员以CEN.PK 102-5B为初始菌株开展ALE。在经过25代连续传代后，分离出稳定突变株5B-2，其最大耐受甲酸浓度提升至0.25%（v/v）。通过梯度生长实验证实0.25%的甲酸是触发该菌株全面适应响应的临界阈值。SEM观察结果显示，在正常条件下酵母细胞呈光滑椭圆形，而在甲酸胁迫下细胞表面发生皱缩。这是因为甲酸解离导致胞内pH急剧下降，细胞需消耗大量三磷酸腺苷（ATP）维持pH稳态，引发渗透失衡和细胞脱水。

甲酸胁迫下酿酒酵母的转录组数据析
为探究5B-2菌株耐受性增强的机制，研究人员进行了转录组学分析。数据分析表明，样本的基因表达值（FPKM）经过校正消除了技术偏差。组内和组间相关系数均符合标准，样本变异极小，表达模式一致性高。通过识别差异表达基因并运用KEGG数据库进行功能富集，揭示了与甲酸耐受性相关的复杂通路和基因富集模式。

甲酸胁迫导致酿酒酵母碳代谢下调及乙醛酸循环通路上调
分析DEGs发现，糖酵解、磷酸戊糖途径（PPP）和糖原代谢等碳水化合物代谢相关基因显著下调。糖酵解中的HK、GAPDH和ENO基因下调阻断了级联反应，抑制了葡萄糖分解和能量底物生成。PPP途径中的PGLS、PGD、E2.2.1.1和TALDO1基因下调阻断了戊糖前体合成和NADPH再生，破坏了氧化还原平衡。此外，海藻糖和糖原合成相关基因显著下调，表明酵母主动抑制耗能的代谢循环以适应能量短缺。相比之下，上调的DEGs主要富集在乙醛酸循环，表明酿酒酵母启动了通路特异性的适应代谢策略来抵抗胁迫。

甲酸胁迫对酿酒酵母MAPK信号通路、细胞周期和减数分裂的影响
转录组分析表明，受外源甲酸影响，酿酒酵母中由信息素通路诱导的MAPK信号通路表达水平显著上升，ERK和FAR1基因被激活。大量与有丝分裂细胞周期相关的基因显著上调，如推动START检查点的CLN1、负责复制许可的CDC6、维持基因组稳定性的CDC45和MRC1，以及驱动G2/M期进程的CLB1/2和CDC5等。部分减数分裂特异性基因也发生表达改变。这表明酵母细胞通过协调上调这些核心调节因子来精确调控增殖周期，并与MAPK信号通路协同应对外部环境挑战。

甲酸胁迫导致核糖体生物发生上调
在甲酸作用下，一系列核糖体生物发生相关基因被上调。涉及18S rRNA处理和40S小亚基成熟的UTP-A、UTP-B和UTP-C复合物成员基因，以及负责60S大亚基组装运输的基因均表达增加。rRNA修饰酶基因和核糖体结构蛋白基因协同过表达，保证了核糖体的结构完整性和功能活性。这种协同机制提升了翻译效率和准确性，支持了胁迫响应蛋白的快速合成，提高了细胞在恶劣环境中的适应性和生存能力。

甲酸胁迫促使酿酒酵母丢弃非必需次级代谢物合成通路
研究人员发现，酵母通过重塑次级代谢网络来应对胁迫。ELO3、ERG5和ERG2等基因上调表明酵母增加了膜脂和固醇合成，以维持膜完整性并抵抗质子泄漏；DAL7(aceB)基因上调增强了乙醛酸循环分流，减少对糖酵解的依赖并支持前体合成。相反，抗氧化和解毒系统相关基因（如CTA1、ALDH和PRODH）显著下调，削弱了清除活性氧（ROS）的能力。脂肪酸β-氧化相关基因下调限制了乙酰辅酶A的生成，影响了次级代谢物前体供应。这表明酵母优先分配资源至生存相关的膜结构和基础代谢，显著抑制了非必需合成途径。

RT-qPCR验证及电催化CO₂还原耦合酿酒酵母生产3-HP
研究人员通过RT-qPCR验证了转录组学测序数据的可靠性。随后，研究人员利用CuO_x催化剂在流通池中成功将CO₂还原为乙醇，同时伴随副产物甲酸的生成。根据计算，连续电解产生的甲酸会抑制未进化菌株的生长。在此基础上，研究人员以5B-2为亲本菌株，依次表达了MCRca、ADH2和ALD6基因以构建3-HP代谢途径。在以0.43 M乙醇为唯一碳源的培养基中培养96小时后，最终构建的菌株5B-6实现了98.5 mg/L的3-HP产量。

在讨论与结论部分，研究人员总结道，通过RNA-seq转录组分析，揭示了酿酒酵母在以乙醇为底物时对甲酸胁迫的响应机制。在核心碳代谢中，糖酵解、PPP途径和多糖合成被广泛下调以减少能量消耗；而乙醛酸循环作为乙醇代谢的关键通路被补偿性上调以补充碳骨架。细胞周期和减数分裂的关键调控基因显著上调，并与MAPK信号通路互作驱动分裂进程。同时，核糖体生物发生全面激活，增强胁迫响应蛋白的翻译。酵母通过上调膜脂和固醇合成维持膜完整性，并下调抗氧化和脂肪酸氧化途径以抑制非必需合成。最终，研究人员初步建立了一个将CO₂电催化还原为乙醇并随后由酿酒酵母转化为3-HP的集成电催化微生物系统。该方法为CO₂直接转化为高附加值化学品开辟了新途径，对促进绿色碳减排和可持续能源存储具有双重重要意义。