T细胞-纳米药物偶联物同步血管正常化与免疫激活用于实体瘤治疗

《SCIENCE ADVANCES》：T cell–nanodrug conjugates synchronize vascular normalization and immune activation for solid tumor therapy

　　

过继性T细胞疗法（ACT）要求T细胞浸润血管组织并维持免疫功能。然而在实体瘤治疗中，周围微环境产生异常血管系统，阻碍T细胞浸润。能够同时实现血管正常化并增强过继性T细胞功能的方法对于有效治疗至关重要，但迄今尚未见报道。研究人员报道了使用乐伐替尼（LEN）诱导短暂血管正常化，从而促进T细胞浸润。此外，LEN通过促进T细胞向记忆表型分化来增强T细胞持久性。研究结果表明，这种分化是通过抑制驱动效应分化的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–蛋白激酶B（AKT）–雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路，以及激活促进记忆形成的转录因子叉头框蛋白O1（FOXO1）来实现的。为协调短暂血管正常化与T细胞增强，研究人员通过酸不稳定点击化学将负载LEN的PD-L1阻断胶束连接至T细胞，形成pH响应性T细胞-纳米药物偶联物。该偶联物同步瘤内释放LEN和PD-L1拮抗肽OPBP-1，从而协调血管正常化、T细胞分化和检查点阻断。在体内实验中，该偶联物使B16-OVA肿瘤中瘤内CD8⁺ T细胞和脾脏记忆T细胞增加六倍以上，并在部分MC38-OVA肿瘤中实现完全消退且无全身毒性，为实体瘤免疫治疗提供了一种有前景的策略。

T细胞-纳米药物偶联物同步血管正常化与免疫激活用于实体瘤治疗的论文解读

**一、研究背景与问题**

过继性T细胞疗法（Adoptive T Cell Therapy, ACT）作为一种利用患者自身T细胞治疗疾病的免疫治疗手段，在血液系统恶性肿瘤中已展现出显著疗效，然而对实体瘤的疗效却十分有限。这一困境主要源于实体瘤微环境中的两大结构性障碍：一是免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）形成的物理屏障，二是肿瘤组织内异常血管系统对T细胞浸润的阻碍作用。在实体瘤中，内皮细胞下调细胞间黏附分子（ICAM-1）和血管细胞黏附分子（VCAM-1）等黏附分子，同时释放包括白细胞介素-6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）和IL-10在内的抑制性血管分泌因子，形成所谓的"免疫排斥性血管微环境"。低剂量血管内皮生长因子受体（VEGFR）阻断虽可诱导局部短暂改善血管结构和氧合，但该正常化效应具有时间局限性，难以与T细胞活化和迁移的动力学过程同步，迫切需要在时空层面协调血管调节与免疫调节。

此外，T细胞的分化状态决定其治疗持久性和抗肿瘤疗效。与终末效应T细胞等更分化的亚群相比，中央记忆T细胞（Central Memory T Cells, TCMs）展现出更优越的增殖潜能、代谢适应性和长寿特性，在维持长期抗肿瘤免疫和ACT模型中发挥关键作用。因此，促进T细胞向TCM分化的策略对延长ACT的治疗持久性至关重要。乐伐替尼（Lenvatinib, LEN）作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂，虽已在临床研究中显示出与程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）阻断的协同效应，但其能否同时实现血管正常化与T细胞记忆分化调控，尚未被系统研究。

**二、研究内容与结论概述**

针对上述问题，研究人员识别出LEN作为双重血管-免疫调节剂的独特功能——既能诱导肿瘤血管短暂正常化，又能促进T细胞向TCM分化。基于此发现，研究人员开发了肿瘤响应性T细胞-纳米药物偶联物（T-LEN-nOPBP-1），通过酸不稳定点击化学将载有LEN和PD-L1阻断肽OPBP-1的胶束连接至T细胞表面，实现两者在肿瘤酸性微环境中的同步释放。该策略在B16-OVA黑色素瘤和MC38-OVA结直肠癌模型中显著增强了T细胞浸润、持久性和抗肿瘤疗效，部分肿瘤实现完全消退且无全身毒性。这项研究为实体瘤免疫治疗提供了时空协调的ACT新策略，发表于《SCIENCE ADVANCES》。

**三、主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法：（1）通过应变促进叠氮-炔烃环加成（SPAAC）点击化学，将酸响应性胶束共价连接至叠氮标记的T细胞表面；（2）利用透射电子显微镜、扫描电子显微镜和动态光散射表征胶束形态及偶联效率；（3）采用Transwell迁移实验和三维肿瘤球体浸润实验评估T细胞迁移能力；（4）应用流式细胞术分析T细胞表型、凋亡和功能；（5）使用Western blot检测PI3K–AKT–mTOR通路蛋白磷酸化水平；（6）通过转录组测序（RNA-seq）分析LEN处理T细胞的基因表达变化；（7）采用小动物活体成像系统追踪T细胞体内分布；（8）在C57BL/6J小鼠皮下建立B16-OVA和MC38-OVA肿瘤模型进行疗效评估。研究涉及的细胞系包括B16-OVA（小鼠黑色素瘤）、MC38-OVA（小鼠结直肠癌，由深圳湾实验室C. Lu提供）、CHO-K1–mPD-L1（稳定表达鼠源PD-L1的CHO-K1细胞）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）。OT-1小鼠（OVA257–264 TCR转基因小鼠）由上海交通大学X. Yang提供。动物实验遵循中山大学伦理委员会批准方案（SYSU-YXYSZ20230605）。

**四、研究结果**

**1. T-LEN-nOPBP-1偶联物的构建与表征**

研究人员通过两种三臂PCL基两亲性分子的自组装构建了酸响应性LEN-nOPBP-1胶束。PCL–OPBP-1实现OPBP-1肽释放以进行检查点阻断，PCL–PEG–DBCO引入DBCO部分用于与叠氮标记T细胞的生物正交偶联。优化的PCL–OPBP-1与PCL–PEG–DBCO比例为16:1，胶束表现出46%的PD-L1阻断活性。透射电子显微镜显示胶束呈球形形态，动态光散射测得平均水合直径为171 ± 26 nm。扫描电子显微镜证实胶束稳定分布在T细胞膜表面。药物释放研究显示pH响应性行为：在pH 7.4条件下24小时释放15.8%的LEN，而在pH 6.0条件下释放65.4%，符合肿瘤微环境酸性特征。

**2. T-LEN-nOPBP-1实现血管正常化与T细胞浸润**

LEN以剂量和时间依赖性方式将紊乱的内皮细胞连接重组为结构化网络，在3 μM处理12小时达到最大正常化效果。体内实验中，LEN（1 mg kg?1）恢复血管排列和灌注，而0.3 mg kg?1无效，3 mg kg?1导致血管修剪和灌注丧失。Vegfr转录在12小时短暂下降，24小时恢复，VEGFR2磷酸化在整个时间过程中保持抑制。Transwell实验显示LEN处理的CD8⁺ T细胞增强迁移能力。在无血管3D肿瘤球体中，LEN处理显著增加T细胞渗透。转录分析显示LEN在T细胞中上调Vla4、Ccr7、Cxcr3和Ccr5，在内皮细胞中增加Icam1、Vcam1和Cd31，在肿瘤细胞中升高Ccl19、Ccl21、Cxcl9、Cxcl10和Cxcl11，形成促进淋巴细胞向实质深处浸润的趋化因子-黏附回路。T-LEN-nOPBP-1偶联物显著增强T细胞对3D肿瘤球体的穿透能力，并显示优越的体内肿瘤定位。

**3. LEN驱动TCM分化并维持效应活性**

LEN处理肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）显著扩增TCM群体，伴随记忆相关标志物TCF1和CCR7表达增加，减少晚期凋亡。LEN处理的T细胞产生更高水平的干扰素-γ（IFN-γ），并表现出更强的抗肿瘤细胞毒性。转录组分析确认TCM表型，显示记忆和效应相关基因（Tcf7、Ccr7、Ifng和Tnf）上调，耗竭标志物（Havcr2、Pdcd1、Tigit和Lag3）下调。在多种TKI比较中，LEN效果最显著，将TCM扩增至65%。机制研究表明LEN通过抑制RTK驱动的PI3K–AKT–mTOR信号通路和减少FOXO1磷酸化来促进TCM分化，更广泛的上游RTK抑制与更有效的PI3K–AKT–mTOR信号衰减和记忆相关T细胞程序化相关。

**4. T-LEN-nOPBP-1增强T细胞编程、持久性和抗肿瘤疗效**

体外功能实验显示，T-LEN-nOPBP-1处理组在所有实验组中TCM频率最高，分泌最多IFN-γ，并表现出最强的肿瘤细胞杀伤能力。体内B16-OVA黑色素瘤和MC38-OVA结直肠癌模型中，T-LEN-nOPBP-1实现最显著的肿瘤抑制效果，优于游离T细胞或非偶联胶束。活体成像追踪显示偶联物在关键免疫器官和肿瘤中大量积累。免疫荧光分析证实治疗显著增加瘤内CD8⁺ T细胞浸润并促进更有序连续的CD31⁺血管结构。流式细胞术分析显示T-LEN-nOPBP-1处理的肿瘤中CD3⁺CD8⁺ TIL比例显著高于所有其他组，脾脏中TCM（CD44⁺CD62L⁺）比例较游离T细胞提高六倍。值得注意的是，MC38-OVA模型中，接受T-LEN-nOPBP-1治疗的7只小鼠中有2只实现完全肿瘤消退，且主要器官苏木精-伊红染色未显示明显组织病理学异常，确认系统耐受性。

**五、讨论与结论**

该研究解决了ACT治疗实体瘤中血管重塑与T细胞激活之间的时空不协调这一核心障碍。研究人员通过鉴定LEN作为双重血管-免疫调节剂，并构建肿瘤响应性T细胞-纳米药物偶联物T-LEN-nOPBP-1，实现了血管正常化、T细胞浸润和免疫激活的同步协调。每个T细胞携带自身药理载荷，仅在酸性肿瘤微环境中释放LEN和OPBP-1，将短暂的药物信号转化为持续的抗肿瘤免疫。未来研究应聚焦于增强T细胞偶联策略的长期治疗持久性，化学偶联的载荷不具备遗传性，将随着抗原驱动的克隆扩增而逐渐稀释。分级补充纳米药物偶联物可利用残余表面叠氮官能团实现额外胶束附着，以可控的非遗传方式延长局部药物递送。以T细胞作为自协调递送单元的策略可扩展至调节代谢、表观遗传可塑性或基质信号传导的制剂。该研究为实体瘤过继性T细胞治疗提供了一种时空可控的新型策略。