《SCIENCE ADVANCES》：Gaseous liquid nitrogen–assisted cryo-printing strategies for challenging volumetric anisotropic tissues fabrication
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工程化生理相关的各向异性组织仍然是一个主要挑战，因为难以在复杂几何形状中复制天然结构线索。在此，研究人员开发了一种低温挤出生物打印平台，通过精确引导冰晶生长来实现厘米级的各向异性构建物，即使使用超软、低粘度墨水（2%重量/体积GelMA）。该方法能够制造解剖匹
工程化生理相关的各向异性组织仍然是一个主要挑战，因为难以在复杂几何形状中复制天然结构线索。在此，研究人员开发了一种低温挤出生物打印平台，通过精确引导冰晶生长来实现厘米级的各向异性构建物，即使使用超软、低粘度墨水（2%重量/体积GelMA）。该方法能够制造解剖匹配、患者特异性的可调各向异性构建物，包括骨移植替代物和骨质疏松症疾病模型。为了克服低温打印的高度限制，研究人员进一步开发了低温组装和LEGO组装策略，允许在保持连续内部排列的同时整合各向异性单元。在伤口愈合、颅骨缺损和股骨缺损模型中的体内研究验证了这些各向异性线索驱动空间引导的细胞迁移、细胞外基质（ECM）重塑和组织位点特异性再生，如ECM沉积所证明。研究人员的平台提供了一种可扩展、临床适应的解决方案，用于工程化结构和功能相关的组织，重新定义了各向异性软组织制造的边界。
**论文解读：气态液氮辅助低温打印策略用于各向异性组织制造**
**研究背景与问题**
天然生物组织，如骨、皮肤、肌腱、神经和肌肉，均具有高度定向的微观结构，这些结构与其生理功能密切相关。例如，骨中的哈弗斯管（haversian canal）沿主承力轴排列，皮肤中高度定向的胶原纤维赋予其抗拉强度和弹性。因此，在体外复制此类各向异性结构对于工程化具有天然力学和生物学特性的功能性组织替代物至关重要。现有制造策略，包括空间图案化（如梯度孔隙率、拓扑结构和剪切应力诱导纤维排列）和物理场辅助方法（如磁场/电场排列和定向冷冻），可通过在凝固过程中引导材料定向来实现层级结构。然而，这些方法大多无法将微观结构各向异性与精确的三维（3D）构型控制整合，尤其在应用于软组织时。研究人员先前开发的垂直低温打印方法虽能生成垂直排列的丝材，但受限于静态平板冻结下的温度衰减和冻结前沿不稳定性，构建物高度仅约6毫米，且各向异性方向固定，严重限制了复杂组织尺度几何中的空间可编程性。因此，克服这一限制需要开发能够将各向异性微观结构形成与单一主导场方向解耦的制造策略，从而在3D构建物中实现区域特异性各向异性。
**研究概述与意义**
为此，研究人员报告了一种基于低温挤出打印的策略，通过方向可控的气态液氮流辅助，实现了在单个构建物内沿多个空间方向的可编程各向异性微观结构。具体而言，研究团队开发了3D垂直和径向挤出低温打印（3D-VECP和3D-RECP）策略，通过精确调控冰晶生长，形成相互连通的垂直和径向排列支架（VAS和RAS）。该策略将各向异性微观结构形成与灵活场方向解耦，即使在低浓度水凝胶墨水中也能实现区域特异性内部构型控制，同时保持几何保真度，解决了软组织支架制造中长期存在的挑战。进一步，通过低温组装和LEGO组装策略实现了各向异性单元的集成，突破了高度限制。在伤口愈合、颅骨缺损和股骨缺损模型中的体内研究验证了各向异性线索引导空间特异性细胞迁移、细胞外基质（ECM）重塑和组织位点特异性再生。该平台为工程化结构和功能相关组织提供了可扩展、临床适用的解决方案，重新定义了各向异性软组织制造的边界。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用自制的低温挤出生物打印平台，集成加热喷嘴以防止喷嘴堵塞，并使用气态液氮环（VLN环和RLN环）提供定向低温气流，引导冰晶生长方向。通过梯度冻结（-5°C至-20°C）结合垂直或径向气态液氮流，实现均匀微通道形成。样本来源：患者来源的CT数据（来自上海东方医院）用于制作个性化骨移植替代物；动物模型包括C57BL/6J小鼠和Sprague-Dawley（SD）IGS大鼠（购自Charles River Laboratories）。主要技术包括：3D-VECP和3D-RECP打印策略，低温组装和LEGO组装策略，以及微CT扫描、组织学染色（H&E、Masson三色）和免疫荧光分析等表征方法。
**研究结果**
* **3D-VECP strategy for fabricating VAS（3D-VECP策略用于制造VAS）**：通过集成加热喷嘴实现温度敏感型GelMA墨水在-20°C下的连续挤出。研究发现，在恒定-20°C平板上直接打印会导致沿打印高度方向孔径增大，而梯度冻结（-5°C至-20°C）可稳定冻结动力学，在高达5毫米高度内实现均匀垂直微结构。进一步开发垂直液氮（VLN）辅助系统，通过连续气态氮流向下延伸冰晶生长，实现10毫米高度VAS的均匀孔径。通过控制紫外（UV）交联频率可延长微通道长度。打印的20毫米高中空圆柱模型在高度方向上保持恒定孔隙率（66.46-68.00%）和孔径（65.70-70.53 μm）。5%（w/v）GelMA VAS的压缩模量达94.83 ± 4.25 kPa，约为常规GelMA水凝胶的79倍。利用该策略成功制造了复杂结构（中空圆柱、等径支气管模型、螺旋晶格），且均保持垂直排列微通道。
* **3D-RECP strategy for fabricating RAS（3D-RECP策略用于制造RAS）**：集成径向液氮（RLN）环，从构建物周围向中心输送-20°C的向心氮气，引导形成高度有序的径向微通道。在2%（w/v）GelMA中形成均匀径向微通道，而5%（w/v）GelMA中从外围到中心孔径逐渐减小（从77.84 μm降至26.95 μm）。不同直径（3-15 mm）圆柱体均保持一致的径向排列。5%（w/v）RAS的压缩模量达44.87 ± 3.72 kPa，约为常规GelMA的37倍。该策略成功制造了中空圆柱、支气管分叉模型和螺旋晶格等复杂结构，且保持外周径向排列。
* **Clinic-associated 3D constructs fabricated via 3D-VECP and 3D-RECP strategies（通过3D-VECP和3D-RECP策略制造临床相关3D构建物）**：利用3D-VECP策略制造了股骨远端和胫骨平台模型，内部孔隙类似天然松质骨。通过患者CT数据制造了个性化肱骨和颅骨骨移植替代物（BGSs），分别具有垂直和径向微通道。利用3D-RECP策略制造了正常和骨质疏松脊柱构建物，通过不同浓度GelMA墨水模拟孔隙率变化。此外，通过低温组装策略制造了具有正交各向异性的神经肌肉接头模拟物和毛细血管网络模拟物。
* **LEGO-assembly of VAS/RAS（VAS/RAS的LEGO组装）**：开发了模块化组装策略，将具有垂直或径向排列的各向异性水凝胶单元通过互锁设计堆叠，形成更大体积的构建物，同时保持连续微通道。两砖VAS组装体孔隙率、孔径和角度分布与单砖相似，压缩模量略有下降（83.35 ± 5.68 kPa），但仍显著高于常规GelMA。罗丹明B扩散实验证实组装界面处微通道连通性良好。两砖RAS组装体也保持了径向排列和机械强度。四砖和八砖组装体进一步证明了可扩展性。
* **Anisotropy-directed cellular responses in vitro and in vivo（各向异性引导的体外和体内细胞响应）**：体外实验显示，VAS和RAS支持人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的活力和代谢活性，并促进成骨分化（通过茜素红S染色证实）。细胞迁移实验表明，hMSCs沿VAS垂直微通道和RAS径向微通道定向迁移，而纯GelMA中细胞浸润极少。体内皮下植入3天后，VAS和RAS中浸润细胞呈现与微观结构一致的纽蛋白（vinculin）排列，且巨噬细胞浸润增加，RAS中M2型巨噬细胞比例更高（54.91%），提示抗炎微环境。
* **Structural anisotropy accelerated wound healing and promoted functional skin regeneration（结构各向异性加速伤口愈合并促进功能性皮肤再生）**：在小鼠背部全层皮肤缺损模型中，RAS和VAS组在第7天和第14天伤口闭合率显著高于GelMA和空白对照组，其中RAS组第14天闭合率达99.15%，再上皮化率100%。H&E染色显示RAS和VAS组肉芽组织更厚，Masson三色染色显示RAS组胶原沉积量最高（第14天75.96%），且胶原纤维排列方向与正常组织相似。CD31免疫荧光染色显示RAS组血管化程度最高（6.64%）。K15（角蛋白15）标记显示RAS和VAS组再生毛发更多，RAS组尤为突出。
* **Anisotropic microarchitectures guided site-specific bone regeneration in cranial and femoral defects（各向异性微结构引导颅骨和股骨缺损中的位点特异性骨再生）**：在大鼠颅骨缺损模型中，GelMA/nHA-RAS和GelMA/nHA-VAS组在4周和8周时骨缺损区域被高度定向的骨小梁填充，骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）显著高于对照组，其中GelMA/nHA-RAS组表现最佳（8周BMD 301.35 mg/cm
3，BV/TV 20.45%）。在股骨远端缺损模型中，GelMA/nHA-VAS组表现出沿纵向轴线的蜂窝状骨小梁再生，BMD和BV/TV最高，且骨小梁数量（Tb.N）最高、骨小梁分离度（Tb.Sp）最低，证明垂直微结构有效引导长骨定向再生。
**总结与讨论**
本研究建立的3D低温打印（3D-VECP和3D-RECP）平台能够制造几何复杂、层级有序且力学稳健的各向异性支架。通过将定向冷冻与挤出打印整合，该平台实现了沉积过程中冰晶生长的精确空间调控。与现有策略相比，该平台克服了单轴约束，可实现厘米级构建物中可编程的垂直和径向微通道排列。微通道方向主要由热提取方向决定，而非挤出参数，孔径可通过材料配方和冷冻温度独立调节。该平台的关键优势在于与低浓度水凝胶墨水（如2% w/v GelMA）的兼容性，通过相变实现瞬时机械支撑，无需牺牲支撑浴。此外，通过动态控制气态氮气流，可实现复杂几何形状上的可编程各向异性，并通过患者CT数据制造个性化BGSs。体内研究证实，各向异性微结构引导细胞定向迁移、免疫极化和ECM组织，并促进位点特异性组织再生。模块化LEGO组装策略为更大构建物的制造提供了概念验证。
**研究结论**：研究团队开发了一种3D低温打印平台，能够实现具有可编程垂直和径向结构的各向异性支架的可扩展制造。通过将定向冷冻与挤出整合，该系统即使在超软水凝胶中也能精确控制冰晶引导的微观结构。研究展示了患者特异性移植物和模块化组装，而体内研究证实了增强的细胞浸润、ECM组织化和组织特异性再生。这项工作确立了冷冻动力学控制作为可编程各向异性组织工程和疾病建模的强大且可推广的设计。
