《SCIENCE ADVANCES》：3D genome organization in tissue regeneration involves long-range chromatin loops
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基因组的三维（3D）组织在基因表达调控中发挥着基础性作用，然而在组织再生过程中，基因组构想的变化如何影响转录反应仍然知之甚少。在此，研究人员利用Hi-C技术对果蝇 wing imaginal disc 再生过程中的3D染色质构想进行了分析。研究人员发现，尽管结
基因组的三维（3D）组织在基因表达调控中发挥着基础性作用，然而在组织再生过程中，基因组构想的变化如何影响转录反应仍然知之甚少。在此，研究人员利用Hi-C技术对果蝇 wing imaginal disc 再生过程中的3D染色质构想进行了分析。研究人员发现，尽管结构域和拓扑关联结构域在很大程度上得以维持，但再生过程伴随着结构域化的减弱和边界绝缘性的下降。研究人员鉴定了三个在再生过程中接触频率增加的长范围染色质环。对其锚点的靶向删除表明，这些染色质环对于 wing disc 的正常再生是必需的，而对于正常的翅膀发育则是非必需的。此外，这些染色质环中的任何一个遭到破坏都会导致基因表达和H3K4me1 3D环境发生趋同变化，这表明它们在再生过程中具有协调活性。这些发现提供了三维基因组结构积极参与再生过程的功能性证据。
基因组的空间组织在细胞分化和发育过程中的基因表达调控中起着至关重要的作用。高分辨率染色体构象捕获技术揭示了基因组被划分为两个主要的区室：活性的A区室和非活性的B区室。这两类区室表现出偏好性的自我相互作用以及截然不同的转录活性。在果蝇中，基因组还会进一步折叠形成拓扑关联结构域，这些结构域由频繁的内部相互作用和将其与邻近区域隔离开的清晰边界所定义。尽管已有证据表明组织损伤后会引发转录重编程和广泛的染色质重塑以实现组织修复，但这种重编程是否涉及更高层次的染色质重组（例如TADs或染色质环的变化）仍不清楚。果蝇的 wing imaginal discs 作为一种能够进行补偿性再生的上皮组织，由于其细胞可塑性和丰富的遗传学工具，成为了解决这一问题的理想模型。虽然既往研究已经描述了再生早期阶段抑制性组蛋白标记的减少和转录的激活，但三维基因组拓扑结构如何响应损伤并参与调控仍属未知。为了探究这一问题，研究人员利用Hi-C技术绘制了 wing imaginal disc 再生过程中的3D基因组互作图谱，揭示了长范围染色质环在组织修复中不可或缺的功能。这项研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为基因组三维结构主动参与组织再生的过程提供了功能性证据。
研究人员主要采用了以下几种关键技术和方法：利用原位Hi-C技术对经过遗传消融处理的 wing imaginal discs 样本进行全基因组范围内三维染色质互作图谱的构建；结合DNA荧光原位杂交在单细胞水平上验证长范围染色质环的空间邻近性；运用CRISPR-Cas9介导的基因组编辑手段精确敲除特定的染色质环锚点序列，并结合染色体缺失杂交构建突变体以评估表型；通过RNA测序技术对突变体再进行转录组的差异表达分析；利用METALoci计算管线将Hi-C数据与表观遗传标记数据结合，进行空间自相关分析以模拟锚点删除对三维染色质环境的影响；使用染色质免疫共沉淀测序探查锚定蛋白的结合特征。
再生过程中三维染色质结构的全局变化
通过对正常和再生 wing discs 进行Hi-C分析，研究人员发现基因组的全局组织结构在损伤后基本得以保留。A/B区室在再生过程中大多维持稳定，区室切换事件相对罕见。然而，研究人员观察到再生过程中区室化强度明显减弱。在TAD水平上，大多数边界特征保持不变，但一部分TAD边界的绝缘性显著降低，同时出现了少量新的、相对较弱的TAD边界。这些变化幅度整体上较为有限。
再生过程中特定长范围染色质环的富集
使用自动化算法对Hi-C图谱进行分析，研究人员鉴定出三个物理跨度超过1 Mb的长范围染色质环：L1、L2和L3。其中L1和L3在再生过程中的互作频率显著增加。DNA-FISH分析进一步证实了这些环的锚点在再生细胞核内的空间邻近性显著提高。研究还发现，这些环的锚点区域在再生过程中染色质可及性增加。 Motif分析暗示特定的转录因子结合位点可能在稳定这些再生相关的环中发挥作用。
再生富集的染色质环是 wing disc 再生所必需的
为了探究这些长范围染色质环的功能，研究人员使用染色体杂合缺失和CRISPR-Cas9敲除技术分别破坏了它们的核心锚点。研究发现，这些突变体果蝇在正常发育中并未表现出明显的翅膀形态异常，但在受到组织损伤诱导后，其再生能力显著受损，且并发破坏L2和L3会导致更严重的再生缺陷。转录组测序揭示了突变体在再生过程中表现出相似的转录组趋同变化，大部分差异表达基因出现上调，这表明这些长范围染色质环主要通过抑制基因表达来参与协调再生过程。
计算模拟删除染色质环锚点导致趋同的 H3K4me1 3D 环境变化
为了深入理解这些环结构的破坏如何影响转录调控，研究人员借助METALoci算法构建了染色质区间的空间布局，并结合H3K4me1表观遗传信号进行了互相关分析。通过模拟在不同锚点处进行序列删除，研究人员发现无论破坏哪个锚点，导致了高度趋同的 H3K4me1 3D 环境改变，尤其是在被删除锚点的相对锚点处。这些预测的结构改变与基因表达的变化趋势相符，表明这三个长范围染色质环在再生过程中共同协调维持着一个特定的染色质调控环境。
介导再生相关锚定环的结构蛋白
研究人员进一步探讨了这些长距离相互作用的结构基础。对多种结构蛋白的ChIP-seq数据进行分析后发现， Cp190 蛋白结合在 L1 锚点上。通过分析现有 Cp190 缺失突变体数据，证实了 L1、L2 和 L3 高度依赖于 Cp190 蛋白的存在。由于 Cp190 缺乏特异性的DNA结合结构域，研究人员通过进一步的数据分析与体内RNA干扰实验确定了 Ibf2 蛋白是招募 Cp190 并介导这些再生特异环形成的关键因子，且这一招募过程对再生至关重要而对正常发育不产生影响。
研究结论与讨论
综上所述，这项研究证明了果蝇 wing disc 再生过程中伴随着染色质区室化的减弱，并且发现了一组在再生过程中特异性增强的长范围染色质环。尽管破坏这些环会导致再生缺陷，但在未受损状态下并不影响正常发育，这提示它们的功能具有高度的损伤响应特异性。研究人员提出模型认为，这些长范围染色质环并不直接驱动附近锚点基因的转录，而是主要发挥结构性调节元件的作用，通过介导较远范围TADs之间的相互作用，维持一个特定的三维染色质调控环境以共同协调基因抑制，这可能对于维持损伤前组织的可塑性以及防止再生过程中的炎症损伤至关重要。此外，该研究明确了 Cp190 在介导这些环组装中的关键作用，并推测 Ibf2 蛋白招募 Cp190 促进了 L1 环的建立，进而层级结构性地引导 L2 和 L3 环的组装。这些发现揭示了三维基因组结构在组织再生中作为额外基因表达调控层面的关键作用。
