不同等离子体活化液体对牙本质内在酶活性的影响

《Plasma》：Influence of Various Plasma-Activated Liquids on Dentin’s Intrinsic Enzymatic Activity

　　

内源性基质金属蛋白酶（MMPs）在龋损进展和修复操作过程中于牙本质中被激活，可降解牙体-修复体界面并导致修复失败。本研究通过原位酶谱法，探究冷大气等离子体活化（PA）蒸馏水（DW）和磷酸盐缓冲液（PBS）是否调节内源性牙本质MMP活性。研究人员采用介质阻挡放电（DBD）棒状源制备PA液体，对DW和PBS处理22分钟。化学表征显示，等离子体活化蒸馏水（PADW）产生9.61 mg/L H₂O₂、18.3 mg/L NO₂^?、375.70 mg/L NO₃^?，pH为3.2；等离子体活化磷酸盐缓冲液（PAPBS）产生9.79 mg/L H₂O₂、36.01 mg/L NO₂^?、505.74 mg/L NO₃^?，pH为7.13。两种液体作为1分钟牙本质预处理，用于模拟修复操作（使用通用粘接剂和树脂复合材料），24小时后检测。MMP活性通过荧光素结合明胶原位酶谱法和共聚焦显微镜评估。数据经统计学分析（p < 0.05）。PADW增加牙本质酶活性，而PAPBS降低酶活性（p < 0.05）。非活化PBS比非活化DW引发更高的基线MMP活性。这种差异反应可能反映了两种液体之间活性氧氮物种（RONS）组成、pH和初始离子含量的差异。PA液体与牙本质MMP相互作用的精确机制有待进一步研究。

**论文解读：等离子体活化液体对牙本质内源性基质金属蛋白酶活性的调控作用**

**研究背景与问题**
牙本质-树脂粘接界面的长期稳定性是牙科修复学面临的核心挑战之一。天然牙本质基质中含有内源性基质金属蛋白酶（MMPs），这些酶在龋齿进展和修复操作过程中被重新激活，降解胶原纤维，导致粘接界面水解，最终引起修复体失败。现有策略（如使用酶抑制剂、交联剂或生物活性材料）虽能部分抑制MMP活性，但往往伴随毒性或操作复杂等问题。冷大气等离子体（CAP）技术因其低温、可控的活性氧氮物种（RONS）生成能力，已展现出抗菌、抗炎及促进组织再生的潜力，但在牙本质酶活性调控方面的研究尚属空白。本研究旨在探讨CAP活化液体（等离子体活化水）是否能够调节牙本质内源性MMP活性，从而为优化牙科粘接修复策略提供新思路。

**研究内容与结论**
研究人员采用介质阻挡放电（DBD）棒状等离子体源，分别对蒸馏水（DW）和磷酸盐缓冲液（PBS）进行22分钟活化处理，获得等离子体活化蒸馏水（PADW）和等离子体活化磷酸盐缓冲液（PAPBS）。通过化学表征定量分析H₂O₂、NO₂^?、NO₃^?浓度及pH值。随后，将这些液体作为牙本质1分钟预处理，模拟临床修复操作（使用通用粘接剂和树脂复合材料），24小时后通过原位酶谱法（荧光素结合明胶底物）和共聚焦显微镜评估MMP活性。结果表明：PADW显著增加牙本质MMP活性，而PAPBS则显著抑制该活性（p < 0.05）。非活化PBS本身比非活化DW引发更高的基线酶活性。该研究首次揭示了等离子体活化液体对牙本质MMP的双向调控作用，并否定零假设（即等离子体活化不影响酶活性）。论文发表于《Plasma》期刊，为牙科粘接界面耐久性提升提供了新的调控靶点。

**主要技术方法**
研究采用以下关键方法：
1. **介质阻挡放电（DBD）等离子体源**：高压电极浸入NaCl饱和导电溶液，玻璃管尖端距液面5 mm，在空气间隙中产生冷大气等离子体，处理DW和PBS 22分钟。
2. **化学表征**：使用Amplex Red过氧化氢检测试剂盒和硝酸盐/亚硝酸盐比色法分别测量H₂O₂、NO₂^?和NO₃^?浓度，pH计测定pH值。
3. **原位酶谱法**：从健康人第三磨牙（n=5）制备1 mm厚牙本质片，每片切分为4份以消除个体差异。液体预处理1分钟后，使用通用粘接剂（自酸蚀模式）和流动树脂复合材料构建粘接界面，37°C人工唾液储存24小时。随后制备50 μm厚切片，覆盖荧光素结合明胶，37°C暗湿环境孵育过夜，共聚焦显微镜（z-stack约15 μm深度）采集荧光图像，ImageJ软件量化荧光整合密度作为MMP活性相对指标。
4. **统计分析**：数据非正态分布（Shapiro-Wilk检验p<0.05），采用Kruskal-Wallis检验和Dunn事后多重比较，显著性水平设p<0.05。

**研究结果**
**3.1 电学分析与RONS化学表征**
DBD源在13.50 kV、12 kHz条件下运行，处理DW和PBS时的平均放电功率分别为138.60 ± 10.55 W和154.32 ± 10.31 W（PBS因离子电导率更高导致功率增大）。PADW的pH为3.42 ± 0.24，PAPBS为7.11 ± 0.15。PADW中RONS浓度：H₂O₂ 9.63 ± 0.07 mg/L，NO₂^? 19.11 ± 1.20 mg/L，NO₃^? 375.70 ± 7.2 mg/L；PAPBS中RONS浓度：H₂O₂ 9.71 ± 0.20 mg/L，NO₂^? 36.1 ± 0.83 mg/L，NO₃^? 505.72 ± 15.26 mg/L。为排除pH影响，另配制与PADW同pH的DW（HCl调节）和同pH的PBS（未调节，因缓冲体系）。

**3.2 树脂-牙本质界面的原位酶谱**
共聚焦图像显示，绿色荧光主要分布于混合层及下方牙本质。非活化PBS组比非活化DW组产生显著更高的基线MMP活性（p < 0.001），表明预处理液体的离子组成本身即可独立影响酶活性。PADW处理组荧光强度高于非活化DW组（p = 0.008），说明等离子体活化蒸馏水增强了牙本质MMP活性；相反，PAPBS组荧光强度低于非活化PBS组（p < 0.001），表明等离子体活化PBS抑制了酶活性。

**讨论与结论**
研究人员指出，PADW的酸化源自酸性氮物种（HNO₃、HNO₂）生成及DW弱缓冲能力，而PBS的磷酸盐缓冲体系维持pH近中性。两种液体对MMP活性的不同影响可归因于RONS组成、pH及离子含量的差异：PAPBS中NO₂^?浓度是PADW的两倍，NO₃^?高约35%，高浓度亚硝酸盐可能引起蛋白质（包括胶原）结构损伤；此外，PBS中的氯离子在等离子体处理中产生次氯酸盐等活性氯物种，亦可能参与抑制效应。MMP活性可能遵循激素效应（hormesis）——低剂量刺激、高剂量抑制。非活化PBS提供更接近生理的离子环境和中性pH，有利于酶活化；而PADW通过RONS激活酶，PAPBS则因过度氧化导致不可逆损伤。此外，RONS可能通过修饰MMP蛋白的氨基酸侧链或二硫键，诱导构象变化，从而影响酶活性。该研究还强调，未来需结合组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）测量，以更全面评估TIMPs/MMPs比值对组织重塑的影响。

**结论翻译**：等离子体处理的PBS和DW在等离子体活化后表现出不同的RONS浓度和pH分布，这可以部分解释它们对MMP激活的不同效应。此外，MMP的活性高度依赖于特定离子的存在，表明PBS和DW之间固有的组成差异可能进一步导致了观察到的酶活性差异。