长期大量饮酒会损害高酒精偏好小鼠的骨骼微观结构与机械性能

《Bone》：Chronic, heavy alcohol consumption detrimentally impacts microarchitectural and mechanical properties of bone in crossed high alcohol preferring (cHAP) mice

　　

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  饮酒的小鼠骨密度及皮质骨指标较低。
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  饮酒小鼠的整个骨骼机械性能较差。
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  饮酒小鼠的骨髓脂肪含量升高。
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  骨折韧性指标未受饮酒影响。
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  乙醇摄入并未改变通过拉曼光谱检测的骨骼成分。

引言

自COVID-19疫情爆发以来，美国酒精使用障碍的病例持续增加，截至2022年，约有3000万人患有此病[1]、[2]。由于该疾病的普遍性和发病率上升，了解其发病机制及后果已成为临床研究的重点[2]。根据《精神疾病诊断与统计手册》第五版（DSM-5）的定义，酒精使用障碍是指“某种饮酒模式导致出现具有临床意义的功能损害或痛苦”[3]。DSM-5还为医生提供了诊断标准，即若在一年内出现两项及以上相关诊断标准，则可诊断为酒精使用障碍[3]。这些诊断标准包括过度饮酒、酒精耐受性以及即便出现负面后果仍继续饮酒的倾向。多种因素都可能增加个体患酒精使用障碍的风险，其中饮酒起始年龄就是重要因素之一。有研究指出，青少年时期就开始饮酒的人日后患酒精使用障碍的风险更高[1]、[4]。除了心理方面的负面影响外，酒精使用障碍还会增加多种严重健康问题的风险，比如癌症、2型糖尿病以及骨骼骨折[5]、[6]。鉴于饮酒会对骨骼造成复杂的影响，酒精使用障碍患者较高的骨折风险尤其值得关注[6]、[7]、[8]、[9]。有研究显示，酒精对骨骼的影响存在剂量依赖性，适量饮酒对骨折风险的影响较小甚至没有影响[5]、[6]、[8]、[10]，而大量饮酒则会增加骨折风险[5]、[6]。这种骨折风险升高的原因可能是酒精使用障碍患者骨密度降低，骨密度是衡量骨量/数量的临床指标[6]。对于那些在青少年时期就开始饮酒的人来说，由于他们的峰值骨量也会更低，骨密度下降的情况可能会更加严重[7]、[11]。骨密度的下降很可能是由酒精使用障碍对骨骼重塑过程的影响所导致的[6]、[7]。在酒精使用障碍患者中，骨吸收与骨形成的平衡被打破，表现为骨吸收增加或保持不变，而骨形成则下降[7]、[8]。这种失衡导致的骨量流失通常被认为是骨折风险升高的原因。不过，由于临床中缺乏其他常规的骨骼检测指标，很难得出确切结论。

因此，人们开始寻求酒精使用障碍的动物模型，以便更深入地了解酒精对骨组织数量和质量的影响。许多研究采用啮齿类动物（通常是C57BL/6J小鼠），通过将乙醇加入饮用水、直接注射、蒸汽吸入、口服灌胃或喂食含乙醇的液体饲料等方式让小鼠接触酒精[6]。这些研究显示，饮酒会导致骨骼形成显著减少[6]、[12]、[13]、[14]。另有研究探讨了酒精对骨骼力学特性的影响，发现酒精会降低骨骼的刚度和强度[14]、[15]。然而，大多数这类模型无法达到具有药理学意义的血液乙醇浓度。在人类中，酒精使用障碍患者的血液乙醇浓度通常在0.10%（100毫克/分升）到0.40%（400毫克/分升）之间，这一范围很适合作为酒精使用障碍模型的参考值[7]、[16]、[17]。而在一些小鼠研究中，仅能达到10毫米摩尔/升（约46毫克/分升）[12]、9.6±2.5毫米摩尔/升（约44毫克/分升）[13]或56毫克/分升[14]的血液乙醇浓度。在那些能够达到相应浓度的研究中[15]，通常是通过强制方式让小鼠饮酒，而人类酒精使用障碍患者则是自愿饮酒。虽然不能忽视强制饮酒对生理状况的影响，因为各种强制给药方式带来的压力可能会激活应激反应机制，进而引发一系列激素变化。尽管这些先前的研究已经为了解酒精对骨骼的影响提供了基础信息，但仍有必要进一步优化酒精使用障碍的动物模型。此外，大多数研究仅对骨骼的数量指标进行了有限检测，这些指标主要与骨量/大小/几何结构相关，包括骨密度、微观结构特征以及部分整体骨骼力学特性[15]、[18]、[19]、[20]，因此有必要在酒精使用障碍的小鼠模型中进一步评估与骨骼数量和品质相关的特性，而这些特性并不依赖于骨量/大小/几何结构。

为弥补这一不足，本研究采用了高酒精偏好型小鼠。与C57BL/6J小鼠不同，高酒精偏好型小鼠并非近交系，而是经过选择性培育后能够自主选择饮用含乙醇的水[21]。这类小鼠是通过将两条高酒精偏好型小鼠品系进行交叉繁殖得到的，即HAP品系1与HAP品系2的交叉后代[22]，随后在这些后代中筛选出在可以自由选择10%乙醇溶液或水的环境下仍会大量饮酒的个体。最初的HAP品系也是通过类似的选择性培育方法从HS/Ibg小鼠品系中培育出来的[22]，而HS/Ibg小鼠品系则是8个近交品系交叉繁殖的结果。研究表明，当高酒精偏好型小鼠可以自由选择饮酒或喝水时，其血液乙醇浓度的平均值可达261.5±18.09毫克/分升，这一数值超过了相同条件下HAP品系以及C57BL/6J小鼠的血液乙醇浓度[22]。此外，这类小鼠即便遇到负面后果仍会继续过量饮酒[23]。综上所述，高酒精偏好型小鼠是研究酒精使用障碍的行为和生理效应的理想模型。本研究将雄性和雌性高酒精偏好型小鼠分别分为饮酒组和饮水组，旨在探究长期大量饮酒对骨骼的影响。研究假设，饮酒的高酒精偏好型小鼠的骨量会因骨密度、微观结构特征以及整体骨骼力学特性的下降而减少，同时骨骼质量也可能出现变化。

章节摘要

实验动物与处理方法

在实验开始之前，所有实验流程都经过了印第安纳大学印第安纳波利斯分校动物护理与使用委员会的批准。本研究使用的是第53代高酒精偏好型小鼠，这些小鼠是在实验室内部培育的。所有小鼠在大约3周大时断奶，然后在允许它们接触酒精之前单独饲养一周。在整个实验期间，这些小鼠可以随时食用标准饲料（普瑞纳LabDiet 5001）并饮用清水。之后，这些小鼠被分为饮酒组

DEXA检测结果

根据小鼠被处死后立即进行的DEXA扫描结果（见表1），饮酒组的骨密度和瘦体重百分比显著下降，而脂肪体重百分比则上升。雌性小鼠的体重和瘦体重百分比低于雄性小鼠，但骨密度却更高。

血液乙醇浓度与酒精偏好程度

在饮酒组中，不同性别的小鼠血液乙醇浓度不存在差异（见图1A）。需要说明的是，雄性和雌性小鼠的血液乙醇浓度分别为227.82±42.24毫克/分升

讨论

本研究以及其他研究都表明，高酒精偏好型小鼠在能够自由选择饮酒或喝水的简单实验环境中，就能够达到具有药理学意义的血液乙醇浓度[22]、[23]、[34]。尽管高酒精偏好型小鼠有望用于模拟酒精使用障碍，但其在行为研究之外的应用仍然较为有限。正是由于这些特点，这类模型成为了骨骼相关研究的理想选择。在本研究中，饮酒组小鼠的骨密度、皮质骨结构以及整体骨骼力学特性均出现显著下降

作者贡献说明

奥利维亚·N·怀特：负责原文撰写——初稿撰写、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。 加勒特·A·温克勒：负责原文撰写——审阅与编辑、资源协调、方法设计、正式分析、数据整理、概念构思。 凯特琳·R·加拉格尔：负责原文撰写——审阅与编辑、方法设计、实验实施、正式分析、数据整理。 戴安·M·塞格维奇：负责原文撰写——审阅与编辑、方法设计、正式分析、数据整理。 科琳娜·E·梅茨格：负责原文撰写——审阅与编辑、软件相关工作

利益冲突声明

作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：

尼古拉斯·格雷厄姆表示，他获得了印第安纳酒精研究中心的财政支持。其他作者则声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

胫骨样本的嵌入、切割和染色工作是由印第安纳大学医学院的组织学实验室完成的。

奥利维亚·N·怀特|加勒特·A·温克勒|凯特琳·R·加拉格尔|戴安·M·塞格维奇|科琳娜·E·梅茨格|亚历克莎·普洛特金|玛丽亚·普拉多|尼古拉斯·J·格雷厄姆|约瑟夫·M·华莱士