Ly6d表达界定两种假定的出生后胸腺上皮祖细胞且其受衰老差异影响

《SCIENCE ADVANCES》：Ly6d expression delineates two putative postnatal thymus epithelial progenitor cells that are differentially affected by aging

　　

迄今为止，出生后胸腺上皮祖细胞（TEPC）的身份与维持机制仍不清楚，包括双能TEPC在出生后是否持续存在，抑或谱系限制性祖细胞是否独立维持皮质（c）与髓质（m）胸腺上皮细胞（TEC）区室亦存争议。研究人员利用基于胸腺蛋白酶体蛋白β5t（由Psmb11编码）表达的可诱导谱系示踪系统——该蛋白在胚胎及部分出生后TEPC中表达——探究了TEC祖细胞与其子代间的早期动态关系。结果识别出两个潜在的谱系偏向祖亚群，以Ly6d表达相区分。此外，研究人员观察到衰老对Ly6d? TEPC的影响显著强于Ly6d+ TEPC，这对衰老胸腺上皮的年轻化策略具有启示。本研究为TEC谱系发育路径及其维持提供了见解，有助于提升衰老与疾病状态下胸腺功能的干预策略。

研究背景：胸腺是初始T细胞发育的主要淋巴器官，其基质核心由胸腺上皮细胞（TEC）构成，分化为皮质TEC（cTEC）与髓质TEC（mTEC）以分别主导阳性选择和自身耐受。单细胞转录组揭示了此前未被充分认识的TEC异质性，包括定位于皮髓交界（CMJ）并共表达cTEC/mTEC特征基因的“中间型TEC（intertypical TEC）”。出生后TEPC的身份长期存在争议：一派认为双能自我更新祖细胞持续存在，另一派主张成体由谱系限制性单能祖细胞分别维持。同时胸腺老化（thymic involution）伴随TEC输出下降，而β5t⁺祖细胞对mTEC的贡献效率随龄降低，提示可能存在其他祖细胞池。本研究即在此框架下，利用β5t可诱导谱系示踪联合流式、scRNA-seq与空间转录组，解析出生后TEPC命运。

主要关键技术方法：研究使用3xtg^β5t小鼠（Psmb11启动子驱动rtTA，多西环素诱导Cre介导ZsGreen报告），于生后7天单剂低剂量多西环素脉冲标记β5t⁺ TEC及其即时子代，在2、10、28、56天追踪；同期分选ZsGreen⁺/ZsGreen^?的cTEC、mTEC进行液滴scRNA-seq（CITE-seq蛋白共检），以Milo进行邻域差异丰度检验；将单细胞数据映射到8周龄胸腺10x Xenium空间转录组以定位Ly6d⁺/Ly6d^?中间型TEC；并以CellChat推断TEC亚型间配体-受体通讯，辅以老年小鼠（至32周）队列对照分析衰老影响。

研究结果：

mTEC偏向前体表达β5t：低剂量多西环素脉冲后，cTEC因组成性表达Psmb11而高比例标记，mTEC仅少数成熟CD80^highAire⁺细胞因Psmb11异位表达被标记；随追访至56天，标记mTEC比例上升并与cTEC下降形成反差，证实β5t⁺出生后祖细胞向mTEC谱系贡献且长期等效，后续选用0.004 mg剂量。

TEC分化发育动态：谱系示踪显示ZsGreen⁺ cTEC比例从91%锐减至11%，而中间型TEC内ZsGreen⁺比例56天内近50倍上升，且累积者为UEA1⁺ mTEC偏向中间型（Ly51^?CCL21⁺Sca1⁺UEA1⁺），而非cTEC偏向亚群；mTEC各成熟阶段均渐次获得标记，Ki67排除增殖偏倚，表明β5t⁺祖细胞生后偏向髓质谱系，中间型TEC为其过渡态。

TEC谱系祖细胞生后早期差异累积：整合2天与10天scRNA-seq，Milo邻域分析在ZsGreen⁺池中富集cycling cTEC偏向中间型与Aire⁺ mTEC，耗尽成熟cTEC；增殖簇中cycling中间型TEC（cluster 15）强富集ZsGreen⁺，且跨数据集映射提示既往所述TAC-TEC实际混杂于中间型TEC cluster 6与Aire⁺ mTEC中，故mTEC祖细胞更宜归入中间型TEC框架。

Ly6d表达区分谱系偏向TEC祖细胞：聚焦最不成熟邻域（clusters 1,6,13,15）再聚类，识别出两群高表达TEPC标志物（Ly6a、Gas1、Itga6、Plet1）的中间型亚群——Ly6d⁺（cluster 4，携Cd52/Aire/Fezf2及I型干扰素信号）与Ly6d^?（cluster 1，携Dll4/Pdpn及Id3/Nfib）。Xenium空间映射与免疫荧光证实Ly6d⁺富集髓质、Ly6d^?富集CMJ/皮质侧；Milo显示两群皆不随时间累积ZsGreen（Ly6d⁺尤甚），暗示其可能早于或平行于β5t⁺状态，少量ZsGreen⁺ Ly6d⁺细胞源于Foxn1⁺下Psmb11启动子微弱泄漏。

Ly6d⁺与Ly6d^?中间型TEC间差异信号：DEG分析获1992个差异基因；Ly6d^?富集细胞周期（Myc/E2F/G2-M），Ly6d⁺富集视黄醇代谢与Lgr6/Garp。CellChat-NMF析出模块1为两群共有输入，含Tweak-Notch-Slit2-Lif信号；Ly6d^?上调Wnt4/5a/6及Fzd2/3/4受体（关联Foxn1），Ly6d⁺上调Fgfr3/4与Igf1r-Itga6，提示Wnt偏向皮质、Fgf/Igf偏向髓质祖细胞维持。

Ly6d^?中间型TEC受衰老影响更强：比对新生与32周老龄邻域，Ly6d^?中间型在ZsGreen⁺与ZsGreen^?池均比Ly6d⁺更显著耗竭（P=5.73×10^?28）；老龄富集Nfib/Txnip/Ackr4，耗竭MHCII与抗原呈递程序，GSEA示IL-6/JAK/STAT、I型/II型干扰素、TGF-β、Wnt-β-catenin等炎症老化特征，解释髓质TEC不成比例丢失。

讨论与结论翻译：TEC发育与成体TEPC身份尚无共识。研究人员通过β5t谱系示踪联合流式与scRNA-seq量化了β5t⁺ TEPC对生后TEC谱系的贡献，发现前9周中间型TEC而非c/mTEC获得标记累积，反映β5t⁺祖细胞由胎期cTEC偏向切换为生后mTEC偏向。研究解析出两个以Ly6d界分的生后祖细胞——Ly6d^?（CMJ/皮质侧，cTEC偏向）与Ly6d⁺（髓质侧，mTEC偏向），后者可能早于β5t⁺态或平行源于β5t^?祖细胞。衰老对Ly6d^?耗竭更剧，构成胸腺退化中mTEC优先丧失的细胞基础。该工作发表于《SCIENCE ADVANCES》，为靶向特定祖细胞亚群（抑炎、重启Wnt/Fgf、纠正干扰素信号）实现胸腺年轻化提供了分子靶点，并指出KGF/Fgf7等生长因子可能广谱作用于中间型TEC，其暂态复幼是否耗竭祖池需进一步验证；3xtg^β5t模型受Psmb11启动子可及性泄漏限制，单细抱分辨率下双能性仍待克隆级示踪确认。