MBNL1劫持一个结构化的单链远端DNA元件以维持KMT2A重排白血病中FLT3的表达

《SCIENCE ADVANCES》：MBNL1 hijacks a structured single-stranded distal DNA element to sustain FLT3 expression in KMT2A-rearranged leukemias

　　

KMT2A重排（KMT2A-r）白血病维持致癌性FLT3表达的分子机制仍 largely unclear，限制了治疗机会。在此，研究人员通过DepMap数据集探索和组合CRISPR筛选，鉴定RNA结合蛋白MBNL1为FLT3的一个意外正调控因子。MBNL1以KMT2A-r背景依赖的方式通过维持FLT3表达促进细胞系和原发肿瘤中白血病细胞存活。机制上，研究人员发现MBNL1通过其锌指结构域和羧基末端非结构化区域识别FLT3增强子内一个包含五个连续鸟嘌呤的结构化单链DNA（ssDNA）元件。这种MBNL1蛋白/ssDNA相互作用在KMT2A-r白血病中通过ChIP-seq和KAS-seq被证实。MBNL1 ssDNA结合表面的关键氨基酸突变或ssDNA中关键鸟嘌呤的突变显著破坏蛋白-ssDNA相互作用。这些发现表明MBNL1通过识别一个结构化的增强子ssDNA元件作为独特的FLT3激活因子，突出了RNA结合蛋白通过直接ssDNA识别在转录调控中的意外作用。

**研究背景与问题**
KMT2A重排（KMT2A-r）白血病在婴儿白血病中占比超过90%，在B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）和急性髓系白血病（AML）中分别约占5%和10%。该亚型预后极差，常规化疗后易复发，且对现有靶向治疗（如menin抑制剂、blinatumomab）存在耐药或谱系转换逃逸。FMS样酪氨酸激酶3（FLT3）是高风险白血病的关键癌基因，在KMT2A-r和大多数AML患者中频繁过表达或发生功能获得性突变；FLT3抑制剂（如quizartinib、gilteritinib）虽有一定疗效，但完全缓解仍困难。过去的研究部分揭示了FLT3激活与转录维持的机制，但针对RNA结合蛋白（RBP）系统调控FLT3的机制尚未被全面阐明。MBNL1是高度保守的RBP家族成员，主要依赖锌指（ZnF1-4）结合前体mRNA调控可变剪接，其在癌症生物学中的作用尚不明确。因此，鉴定KMT2A-r白血病中FLT3的新调控因子并阐明其机制具有重要治疗意义。

**研究内容与结论**
研究人员通过DepMap数据集分析（CDAA算法）和组合CRISPR筛选（包括dropout筛选和FLT3蛋白染色报告筛选），意外发现RBP MBNL1是FLT3的正调控因子。MBNL1以KMT2A-r背景依赖的方式维持FLT3表达，从而促进白血病细胞系和原发肿瘤的存活；回补FLT3 cDNA可部分挽救MBNL1缺失导致的增殖缺陷。机制上，MBNL1通过其N端四个锌指结构域（ZnF1234）和C端非结构化区域，直接识别FLT3增强子中一个含有五个连续鸟嘌呤（polyG5）的结构化单链DNA（ssDNA）元件，该元件形成四聚体G4样结构。ChIP-seq和KAS-seq证实MBNL1在KMT2A-r细胞中特异性结合此ssDNA区域，而在非KMT2A-r细胞中不结合。关键氨基酸（如Y68、I51/F54、K67/R84、K235）突变或polyG5中鸟嘌呤的替换显著破坏蛋白-ssDNA相互作用，并削弱MBNL1对FLT3的调控及细胞增殖。该研究将MBNL1从剪接调控因子重新定义为背景依赖的转录激活因子，揭示了RBP通过直接识别结构化ssDNA进行转录调控的新范式，为靶向MBNL1-ssDNA界面治疗KMT2A-r白血病提供了新思路。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**主要技术方法**
- 数据挖掘与计算分析：开发CDAA算法（基于DepMap数据集）鉴定与FLT3表达正相关的基因。
- CRISPR筛选：使用靶向~1800种RBP的sgRNA文库进行dropout筛选（在MOLM13细胞中），以及FLT3蛋白染色报告筛选（在SEM细胞中）。
- 染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）：对内源或外源HA标记的MBNL1进行ChIP-seq，鉴定其染色体结合位点。
- 酮基辅助单链DNA测序（KAS-seq）：在KMT2A-r细胞（SEM）和非KMT2A-r细胞（K562）中检测全基因组ssDNA构象。
- 生化与结构分析：电泳迁移率变动分析（EMSA）、荧光偏振（FP）、核磁共振（NMR）滴定、热位移分析，用于鉴定MBNL1与ssDNA的相互作用界面及结构特征。
- 细胞功能实验：竞争性增殖实验（CPA）、集落形成实验（CFU）、原代AML样本（来自苏州大学附属第一医院）和健康供体CD34⁺造血干细胞/祖细胞（HSPC）的转导与功能检测。
- 降解系统：FKBP-dTAGv1系统用于急性诱导MBNL1降解，评估其对FLT3蛋白水平的影响。

**研究结果**
**鉴定RBP MBNL1为人类KMT2A-r白血病中FLT3的调控因子**
通过CDAA算法和CRISPR筛选，发现MBNL1是FLT3表达的正调控因子，多个sgRNA靶向MBNL1导致FLT3低表达细胞富集。

**MBNL1对KMT2A-r白血病细胞适应性维持的贡献**
在MOLM13、SEM和OCI-AML2细胞中，MBNL1敲除导致CFP⁺细胞比例随时间下降；回补FLT3 cDNA显著挽救增殖缺陷，说明MBNL1通过调控FLT3影响细胞存活。

**MBNL1蛋白表现出高度选择性和非经典染色质占用**
ChIP-seq显示MBNL1在全基因组中仅有约20个可重复峰，其中两个位于基因调控区（EEF1A1启动子和FLT3远端增强子），且与HOXA9、MEIS1等转录因子及BRD4等表观调控因子相邻。

**MBNL1结合并调控FLT3增强子以控制KMT2A-r细胞存活**
CRISPR干扰（dCas9-KRAB）和Cas9介导的MBNL1结合位点（BS）敲除均导致KMT2A-r细胞（SEM、MOLM13、MV411）增殖受损，而非KMT2A-r细胞（K562、Nalm6）无影响；增强子区域的其他sgRNA仅在扩增的超级增强子细胞中产生效应。

**MBNL1在原代KMT2A-r AML中发挥关键作用，但在HSPC中不显著**
在3例原代KMT2A-r AML样本中，MBNL1敲低降低FLT3蛋白水平并抑制集落形成；而在正常CD34⁺ HSPC中，MBNL1敲低不影响FLT3表达或集落形成。

**MBNL1以单链构象及二级结构结合FLT3增强子DNA**
EMSA和FP实验表明，MBNL1 ZnF1234和全长蛋白优先结合FLT3增强子中22nt的ssDNA片段（ssC4-3），该片段含polyG5并形成G4样四聚体结构；NMR证实该结构形成G-tetrad特征信号；RNA/ssDNA异源四聚体同样被MBNL1识别。

**MBNL1蛋白FLT3增强子结合界面的表征**
NMR滴定显示ZnF1234的ZnF1-4及螺旋I区域参与ssC4-3结合；关键氨基酸突变（Y68A、I51/F54A、K67/R84A、K67/K235A）分别减弱或消除ssDNA结合活性，而RNA结合活性部分保留；FKBP-dTAGv1降解实验表明，ssDNA结合缺陷的MBNL1突变体无法维持FLT3表达和细胞增殖。

**FLT3增强子在KMT2A-r细胞中呈单链DNA构象**
KAS-seq与ATAC-seq联合分析显示，仅在KMT2A-r SEM细胞中，MBNL1结合位点处的FLT3增强子区域呈现强ssDNA信号，而在非KMT2A-r K562细胞中缺失，且该区域富集CTCF基序和关键转录因子（KMT2A、MED26等）。

**讨论与结论**
本研究将MBNL1从剪接调控因子重新定义为背景依赖的转录激活因子，其通过直接识别FLT3增强子中的结构化ssDNA元件驱动白血病维持。该发现揭示了DNA结构状态作为RBP招募和功能关键决定因素的新基因调控层次，为靶向MBNL1-ssDNA界面提供治疗途径。与RBM5调控HOXA9类似，MBNL1的转录调控功能不依赖其经典剪接活性。KAS-seq数据表明，该ssDNA构象在KMT2A-r细胞中特异存在，解释了MBNL1调控的谱系选择性。研究结论：总之，这项工作将MBNL1从一个剪接调控因子重新定义为一个背景依赖的转录激活因子，通过ssDNA增强子结合驱动白血病维持。它揭示了基因调控的一个新层次，其中DNA结构状态作为RBP招募和功能的关键决定因素。这一范式转变不仅加深了研究人员对KMT2A-r白血病调控网络的理解，而且为通过靶向MBNL1-ssDNA界面进行治疗干预开辟了新途径。