《Cellular Signalling》：METTL4 knockout alleviates sepsis-induced liver injury via inhibiting NCOA4-mediated ferritinophagy and ferroptosis
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摘要在脓毒症的发展过程中，肝脏往往是首先受到损害的器官。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的特异性调控性细胞死亡方式，已被证实与脓毒症引发的肝脏功能障碍的发病机制有关。然而，在脓毒症状态下，m6A修饰的RNA如何调控肝细胞中的铁死亡机制仍不清楚。在本研究中，我们发现脓毒症引起的
摘要
在脓毒症的发展过程中，肝脏往往是首先受到损害的器官。铁死亡是一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的特异性调控性细胞死亡方式，已被证实与脓毒症引发的肝脏功能障碍的发病机制有关。然而，在脓毒症状态下，m6A修饰的RNA如何调控肝细胞中的铁死亡机制仍不清楚。在本研究中，我们发现脓毒症引起的肝脏损伤中m6A修饰水平显著升高，这与m6A甲基转移酶METTL4及其识别蛋白YTHDF1的表达上调密切相关。进一步的研究在脓毒症小鼠中探讨了METTL4介导的m6A修饰作用，发现NCOA4是该修饰的目标基因。此外，敲低NCOA4能够改善LPS诱导的线粒体功能障碍、脂质过氧化以及肝脏损伤。由此可知，METTL4通过在对NCOA4进行m6A修饰来稳定其mRNA表达，进而促进LPS诱导的THLE-2细胞中的铁蛋白吞噬作用。作为m6A修饰的NCOA4 mRNA的识别蛋白，YTHDF1能够提升NCOA4的稳定性。这一调控轴会加速铁死亡途径的启动，从而加剧脓毒症相关的肝脏损伤。总之，本研究揭示了METTL4在LPS诱导的肝细胞铁死亡调控中的关键作用，为治疗脓毒症引发的肝脏损伤提供了潜在的治疗靶点。
引言
脓毒症是一种危及生命的临床综合征，其特征是机体对感染的反应出现紊乱，常常导致多器官功能逐渐衰竭，是全球范围内主要的死亡原因之一[1]、[2]。临床证据表明，肝脏功能障碍不仅是脓毒症的早期临床表现，也是重症患者死亡率升高和预后不良的重要预测因素[3]。在败血症发作期间，肝脏损伤是由多种病理生理过程共同导致的，包括炎症信号传导紊乱、细菌移位、微循环障碍、代谢紊乱以及程序性细胞死亡[4]。
铁死亡是一种独特的、受调控的细胞死亡形式，其发生依赖于铁元素，其特征是氧化还原平衡被打破，从而导致具有杀伤性的脂质过氧化物大量积累[5]。铁蛋白吞噬作用则是一种选择性自噬过程，它通过将铁蛋白转运到溶酶体并使其降解释放出游离铁，从而调节细胞内的铁含量。作为铁死亡的上游调控途径，铁蛋白吞噬作用可以通过调控自噬相关蛋白核受体共激活因子4（NCOA4）和铁蛋白的水平，影响铁元素的释放以及后续的铁死亡过程[6]。近期有一些研究指出，由铁蛋白吞噬作用介导的铁死亡与脓毒症引发的肝脏损伤有关[7]、[8]、[9]。我们之前的研究已经发现，在脓毒症引起的肝脏损伤中，依赖NCOA4的铁蛋白吞噬作用是推动肝细胞发生铁死亡的关键因素[10]。不过，仍需更多证据来阐明铁死亡的发病机制，尤其是脓毒症引发的肝脏损伤中由铁蛋白吞噬作用介导的铁死亡途径，以及寻找潜在的治疗靶点。
N6-甲基腺苷（m6A）修饰作为一种重要的表观遗传调控因子，因其在基因表达的转录后调控中的作用而备受关注。m6A是真核生物信使RNA中最常见的内部修饰类型。这种可逆的修饰过程由甲基转移酶（“写入酶”）、去甲基化酶（“擦除酶”）以及结合蛋白（“读取酶”）共同调控，它们协同作用以调节RNA的代谢与功能。“写入酶”是一类甲基转移酶，包括METTL3、METTL14、METTL4、WTAP等；“擦除酶”也就是去甲基化酶，包括FTO和ALKBH5等蛋白质；“读取酶”则包括YTHDF家族（YTHDF1–3）和YTHDC家族（YTHDC1、YTHDC2）中的多种m6A结合蛋白[11]、[12]。甲基转移酶样4（METTL4）已被确认为一种哺乳动物甲基转移酶，能够在多种真核生物中负责RNA和DNA的N6-腺苷甲基化修饰[13]。在肝星状细胞发生铁死亡时，m6A修饰水平的上升是由于METTL4的表达增加，同时FTO的表达水平下降所导致的[14]。在脓毒症相关的肺损伤研究中，我们的结果表明，METTL4会在Nrf2的m6A修饰之后，进一步促进肺泡上皮细胞发生铁死亡[15]。然而，目前关于METTL4在脓毒症相关肝脏损伤发病机制中的作用的研究还相对较少。
在本研究中，我们致力于探索脓毒症引发的肝脏损伤中铁死亡的相关信号通路及机制。为了验证“METTL4通过在脓毒症引起的肝脏损伤过程中对NCOA4进行m6A修饰来促进铁死亡”这一假设，我们构建了METTL4基因被沉默或过度表达的小鼠模型。
章节节选
实验动物与模型
本实验所使用的动物为8–10周龄、具有C57BL/6 N基因背景的野生型雄性小鼠，这些小鼠由中国苏州的Cyagen公司提供；Sh-METTL4基因改造小鼠则由中国苏州的Cragen公司提供。所有实验动物均被喂食无菌食物和水，饲养在温度可控的设施中，且该设施遵循12小时白昼/黑夜的周期。本实验的设计方案已获得武汉大学动物伦理委员会的批准。
我们采用了盲肠结扎穿刺模型来诱发脓毒症相关的肝脏损伤。
脓毒症引发的肝脏损伤中整体m6A修饰水平及甲基化调控因子的紊乱
为探究m6A修饰是否参与了盲肠结扎穿刺模型诱发的肝脏损伤，我们对肝脏组织中的整体m6A修饰水平进行了检测。结果显示，m6A修饰水平呈时间依赖性显著上升（在0、6、12、24、48小时时均有上升），并在48小时时达到最高水平（见图1A）。此外，我们还通过RNA点印迹分析和比色ELISA技术，检测了正常小鼠和脓毒症小鼠肝脏中的m6A RNA水平（见图1B、C）。研究结果发现，这两组小鼠的总RNA m6A修饰水平均出现了显著的上调。
讨论
在本研究中，我们明确了METTL4是通过对NCOA4进行N6-甲基腺苷（m6A）修饰来促进铁蛋白吞噬作用，进而加重脓毒症引发的肝脏损伤的。我们发现，甲基转移酶METTL4的表达上调会提高NCOA4 mRNA的m6A修饰水平。这种修饰随后会被识别蛋白YTHDF1所识别，进而提升NCOA4 mRNA的稳定性和翻译效率。这一分子机制最终会促使线粒体活性氧的释放与积累。
结论
本研究揭示了m6A表观遗传调控与脓毒症引发的肝脏损伤中的铁死亡之间的重要关联。我们证明了METTL4会促进NCOA4的m6A修饰，而这一修饰又会得到YTHDF1的稳定作用。这一机制会推动NCOA4介导的铁蛋白吞噬作用，最终导致肝细胞发生铁死亡。明确METTL4/YTHDF1/NCOA4这一调控轴不仅有助于阐释一种新的致病途径，也为脓毒症患者的救治提供了新的治疗策略。
作者贡献说明
罗琼：论文初稿撰写、实验研究、资金申请、数据整理。李玲：论文初稿撰写、研究方法设计、研究概念构思。金哲：软件应用、定量分析。沈梦梦：软件应用、定量分析。李一成：研究方法设计、定量分析。胡琳：定量分析、研究方法设计。杨淼：定量分析。王进：论文审阅与编辑、研究指导、资金申请、研究概念构思。张静：论文初稿撰写、数据可视化、实验研究。
利益冲突声明
所有作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本项研究得到了中国湖北省自然科学基金的支持（项目编号为2024AFB805和2024AFB726）。
罗琼|李玲|金哲|沈梦梦|李一成|胡琳|杨淼|王进|张静
中国湖北省武汉市武昌区东湖路169号武汉大学中南医院麻醉科，邮编430071
