《Visual Neuroscience》：Vascularized retinal organoids and vascularization strategies for retinopathy 3-dimensional modeling
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新生血管性视网膜病变以病理性血管生成为特征，仍是导致视力丧失的主要原因之一。血管化视网膜类器官（vROs）已成为先进的三维（3D）模型，通过整合功能性血管系统来重现视网膜微环境。本综述重点介绍了关键的血管化策略，包括共培养系统、干细胞分化、3D生物打印和器官芯
新生血管性视网膜病变以病理性血管生成为特征，仍是导致视力丧失的主要原因之一。血管化视网膜类器官（vROs）已成为先进的三维（3D）模型，通过整合功能性血管系统来重现视网膜微环境。本综述重点介绍了关键的血管化策略，包括共培养系统、干细胞分化、3D生物打印和器官芯片技术。这些方法能够实现疾病建模和药物筛选，尽管在血管成熟和标准化方面仍存在挑战。未来的发展将聚焦于患者特异性模型和灌注系统，以增强vROs在新生血管性视网膜病变研究和治疗开发中的转化潜力。
引言
新生血管性视网膜病变是全球范围内导致失明的主要原因之一。尽管病因各异，但这些疾病共同具有缺血、缺氧驱动的病理性新生血管形成。目前针对血管内皮生长因子（VEGF）的疗法未能解决所有临床挑战，因此需要探索替代的致病机制和治疗策略。准确建模需要能够重现视网膜血管病理生理的系统。尽管动物模型和二维（2D）培养推动了生物医学研究，但它们存在固有局限性，如物种差异或缺乏天然组织复杂性。近年来，由多能干细胞衍生的3D自组织视网膜类器官（ROs）已成为能密切模拟天然视网膜结构和细胞组成的强大工具。然而，非血管化ROs缺乏氧气、营养和药物运输所必需的微血管，并在长期培养中因灌注不足而发生萎缩。如何血管化ROs仍是一个主要挑战。为此，研究人员开发了多细胞共培养、3D生物打印和微流控平台等策略，以将功能性内皮网络整合到ROs中。这些方法旨在将具有灌注能力的内皮网络纳入ROs，从而提高其生理相关性并扩展其在生物医学研究中的适用性。尽管ROs研究已取得显著进展，但关于血管化视网膜类器官（vROs）的研究仍相对有限。本综述总结了当前血管化类器官的构建方法，旨在为vROs的开发及其在新生血管性视网膜病变研究中的应用提供见解。
血管化类器官构建
近期进展增强了血管化类器官在疾病建模和转化研究中的潜力。其生成既是研究新生血管疾病的关键工具，也是构建vROs的前提。这些类器官主要通过细胞自组装或预形成血管网络生成，两者都需要合适的内皮来源和具有可调力学特性的水凝胶来支持细胞-基质相互作用。
血管工程中的材料来源
内皮细胞（ECs）和支撑细胞
ECs是血管网络的主要组成部分。常见来源包括用于筛选的人脐静脉ECs、用于屏障建模的器官特异性ECs，以及用于患者特异性应用的多能干细胞（PSC）-ECs。支撑细胞如周细胞和间充质干细胞（MSCs）通常共培养以稳定血管并促进成熟。
血管工程中的水凝胶材料
水凝胶为内皮网络形成提供3D仿生基质。天然水凝胶如胶原蛋白和Matrigel支持血管生成，而合成水凝胶提供可调的机械特性和批次一致性。
基于细胞自组装机制的血管化类器官构建
基于细胞和水凝胶，血管化类器官通过两种方法开发：细胞自组装和预形成血管网络整合。自组装包括多细胞共培养和类器官共分化。在多细胞共培养中，血管ECs与支撑细胞（包括周细胞和间充质干细胞（MSCs））在3D水凝胶基质中共同培养，以形成血管化类器官，利用细胞迁移、组织和分化在支持性微环境中进行。这种方法避免了刚性支架，而是依赖细胞类型和细胞外基质（ECM）组分之间的自然相互作用来形成有腔血管网络。虽然多细胞共培养策略能有效形成基本血管结构，但可能无法完全复制器官特异性血管的复杂性和功能整合。为解决这一问题，研究人员开发了共分化系统，诱导PSCs同时分化为血管谱系和器官特异性细胞。这种方法借鉴胚胎发育过程，其中血管网络与周围组织共同进化，形成结构和功能协调的系统（图1）。
共分化策略也推动了肾脏、大脑、胰腺、肝脏和心脏类器官的开发，其中血管祖细胞与组织特异性祖细胞共同诱导，形成可灌注且生理相关的血管。这些模型不仅提高了血管形成的效率，也增强了组织成熟的保真度。然而，协调多个分化谱系在技术上要求很高，因为微小偏差可能损害组织功能。许多当前模型缺乏功能性灌注系统，限制了体内模拟。最后，标准化方案的缺乏阻碍了可重复性和临床转化。
通过预形成血管网络的血管化类器官构建
虽然多细胞共培养和共分化策略显著推动了血管化类器官的发展，但它们通常需要较长的培养时间，并可能导致不成熟或灌注不良的血管。另一种方法涉及预形成血管网络，提供即时灌注能力和结构支持。这种自上而下的策略增强了类器官活力，改善了营养输送，并促进了更生理相关组织的形成。在当前的血管网络构建方法中，最广泛使用的是3D生物打印技术和器官芯片（OoC）平台，两者都能实现精确的空间组织和动态微环境控制。
三维生物打印技术
三维生物打印已成为构建复杂组织结构的强大工具，通过精确沉积生物墨水（细胞、水凝胶和生物活性分子的混合物）来实现。该技术克服了传统组织工程的空间限制，并能创建解剖学和功能准确的血管结构。根据具体实验目标，可选择不同的生物打印技术（图2）。挤出式生物打印适用于打印大型厘米级结构，具有高细胞密度和机械稳定性，而激光辅助生物打印提供微米级分辨率，用于生产精细血管图案。相比之下，液滴式生物打印提供中等分辨率和相对较快的打印速度，使其有效用于快速逐层构建血管特征。
近期研究已证明其在多个器官系统中的实用性。在视网膜研究中，青光眼模型的3D生物打印显示，ECs仅在包含视神经头星形胶质细胞和视网膜神经节细胞（RGCs）的支架中优先形成血管管，证明了生物打印在构建视网膜相关血管化模型中的潜力。其他先进方法，如电流体动力打印、多光子引导打印、体积生物打印和嵌入式打印，已能创建复杂、可灌注且层级组织的血管网络。
与常规血管化策略相比，3D生物打印提供了无与伦比的空间精度、多种生物墨水兼容性，以及厘米级制造层级组织的血管网络，这些网络整合到类器官中并重现天然组织结构。然而，当前技术面临分辨率、打印速度和细胞活力之间的权衡，以及实现均匀细胞分布、打印期间实时灌注有限和复制剪切应力等动态生理线索的困难。将生物打印与实时成像和计算建模相结合，继续增强其生成适应特定解剖和生理要求的血管化结构的能力。
血管化器官芯片技术
除生物打印外，OoC技术已成为构建血管化类器官的另一个前沿平台。通过将干细胞衍生组织与微流控系统结合，OoC平台重现了与体内生理条件密切相似的动态微环境。这些系统能精细控制流动动力学、营养和氧气输送以及时空信号，这些对功能性微血管的形成和成熟至关重要。典型的OoC设备包括一个用于组织生长的中央培养室和相邻的微流控通道，提供连续灌注，模拟血流并促进代谢交换。
OoC平台在模拟血管生成、组织-组织界面形成和疾病特异性微环境方面非常有效。例如，Seiler等人将患者来源的肠道肌成纤维细胞整合到肠道芯片中，诱导内皮细胞形成可灌注的毛细血管网络，重现黏膜下血管结构。类似地，Rayner等人将肾小管上皮细胞和ECs在连续微流控流动下共培养于肾脏芯片中，成功重现了血管-肾小管界面。Akinbote等人进一步将这些方法扩展到肺和心脏组织，其中器官特异性微血管芯片在不同灌注条件下揭示了每种组织特有的纤维化反应。
组织界面重建是OoC技术的另一个主要优势。例如，Liu等人设计了一个肝脏芯片，其中实质肝细胞和ECs被分区，在其界面建立稳定的营养交换通道。该模型强调了血管-实质相互作用在维持组织功能中的关键作用。同样，Hospodiuk-Karwowski等人通过将胰岛细胞与血管组分结合在仿生细胞外基质中开发了胰腺芯片，为研究糖尿病中的胰岛-血管串扰提供了新平台。
尽管有这些优势，OoC技术仍面临某些限制，包括构建尺寸有限、高通量应用放大困难、设备制造复杂性以及下游分析中细胞提取的难度。解决这些技术障碍仍是活跃的研究领域。
总体而言，通过3D生物打印和OoC技术整合预形成血管网络，为血管化类器官提供了强大且高度可控的手段。这些方法能够生成具有精确结构和灌注的生理相关组织模型，从而增强类器官在再生医学、药物筛选和个性化医疗中的适用性。
视网膜类器官的血管化策略
ROs是由人诱导多能干细胞衍生的3D自组织视网膜组织，在优化培养条件下重现层状结构并生成主要视网膜细胞类型。尽管有这些进展，ROs的一个主要局限性是完全缺乏血管，这阻止了由内皮紧密连接组成的内血-视网膜屏障（iBRB）或由视网膜色素上皮（RPE）、Bruch膜和脉络膜内皮形成的外血-视网膜屏障（oBRB）的形成。随着ROs增大，缺乏灌注导致缺氧、营养剥夺和中心凋亡，最终限制成熟和长期活力。为解决这一问题，已开发了几种血管化策略来生成vROs。
Chen等人通过在V形底聚二甲基硅氧烷微孔平台上共培养血管化类器官和ROs，开发了一种vRO模型，表达紧密连接蛋白claudin-5并类似iBRB。Xue等人开发了一种基于单向微流控的可灌注视网膜芯片（RoC）生物反应器，显示与静态培养相当细胞类型、形态和视网膜基因表达。
同时，vROs成为研究复杂代谢性视网膜病变（特别是增殖性糖尿病视网膜病变（pDR））的强大工具。在高葡萄糖培养条件下，vROs表现出典型的pDR样表型，包括类器官大小减少和视网膜神经节细胞（RGCs）显著丧失，表明其适合模拟糖尿病条件下发生的协同神经血管损伤。高葡萄糖刺激的ROs重现了pDR的多个关键早期病理变化，如RGCs和无长突细胞丧失、星形胶质细胞和小胶质细胞反应性增加，以及炎症因子（包括VEGF和白细胞介素（IL）-1β）表达显著升高。这些体外模型提供了高度可控的平台，以阐明pDR的分子机制并筛选抗炎和抗血管生成疗法。
尽管oBRB建模通常不被视为标准vRO系统的一部分，但模拟oBRB的实验平台正在不断发展，用于研究脉络膜新生血管。一种常见方法涉及共培养ECs以在视网膜色素上皮（RPE）周围形成毛细血管样网络，模拟脉络膜血管的某些方面。RPE本身在引导血管模式和血管生成中起关键作用。进一步与血管化类器官来源的ECs和周细胞共培养可增强血管整合，并显著上调神经元成熟标志物，表明神经血管相互作用支持视网膜发育。利用纳米材料进展，一种可冷冻保存、即用型OoC平台整合纳米纤维膜已验证用于oBRB建模。Paek等人开发了一种微图案化水凝胶构建体，置于弹性体微设备内，以更真实地重现RPE和下方脉络膜血管床的空间组织。越来越多的研究将oBRB建模应用于疾病背景，如湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD），以重现病理状态。Manian等人将wAMD患者来源的诱导多能干细胞衍生的RPE、EC和MSC整合到ECM平台中，重现了关键疾病表型。Song等人通过生物打印ECs、周细胞和成纤维细胞在可生物降解支架的基底侧，然后在顶端侧建立RPE单层，工程化了一种3D oBRB组织。该系统内补体激活诱导了类似wAMD的表型。
总之，vROs代表了建模新生血管性视网膜病变的有前途的工具，通过提供生理相关平台进行疾病机制研究和药物筛选。尽管存在血管穿透深度、空间分辨率和整合性等当前挑战，但生物打印、微流控和干细胞编程等新兴技术继续推动该领域进步。
未来展望与挑战
随着再生医学和类器官技术的持续进步，类器官模型在多种疾病研究中显示出巨大潜力。对于新生血管性视网膜病变，血管化类器官模型提供了可控、可重复且功能相关的体外平台，克服了传统细胞培养和动物模型的局限性。尽管有进展，但在模拟视网膜血管微环境和实现功能性血管重建方面仍存在挑战。未来研究应关注以下领域。
血管化类器官的器官特异性构建仍不完善，特别是对于具有独特屏障结构和生理功能的视网膜。当前血管化方法常使用非视网膜来源的细胞，如人脐静脉内皮细胞（HUVECs），这些细胞无法完全重现视网膜微血管内皮细胞的特征。未来研究应旨在从诱导多能干细胞或成体干细胞中高效诱导视网膜特异性ECs。
当前血管化类器官常面临成熟度低和不稳定性问题。在缺乏剪切应力等动态线索的情况下，血管生长不规则并失去屏障功能。微流控系统可提供连续灌注和剪切力以促进血管成熟。多组学可监测发育过程并识别关键信号轴以增强稳定性。
最后，标准化和大规模生成仍是关键挑战，包括定义细胞来源、优化培养基和设计灌注通道，以及质量控制体系。未来，人工智能辅助图像分析、生物打印和3D成像技术的整合可能推动高通量类器官构建和评估系统的发展，加速其在视网膜病变研究中的应用。
总之，血管化类器官正成为研究新生血管性视网膜病变的强大体外模型。随着多学科技术的持续融合和优化，这些模型有望在疾病机制研究、药物开发和个性化医疗中发挥越来越重要的作用，最终推动再生和精准眼科的进步。
结论
vROs为新生血管性视网膜病变研究提供了变革性平台，桥接体外系统和体内生理。通过使用多细胞共培养、干细胞共分化、3D生物打印和OoC技术，vROs更好地重现了视网膜微环境，使机制研究和治疗筛选成为可能。尽管仍存在挑战，特别是在实现组织特异性血管身份、功能性灌注和可扩展标准化方面，但生物材料、干细胞生物学和微工程领域的持续创新。未来，vROs有望成为基础研究和临床治疗之间的重要桥梁，为新生血管性视网膜病变的预防和治疗提供新视角和技术支持。
