RPE65缺陷通过损害VGF信号传导破坏内层视网膜结构在LCA中

《Visual Neuroscience》：RPE65 deficiency disrupts inner retinal architecture via impaired VGF signaling in LCA

　　

RPE65缺陷导致Leber先天性黑矇（LCA），该疾病经典特征为光感受器变性，但其内层视网膜受累情况仍不明确。研究人员（此处用研究人员代替“我们”）鉴定出两名携带新型复合杂合RPE65变异（p.Glu399*/p.Pro467Ala）的中国同胞LCA患者，表现为夜盲和非典型白色点状眼底病变。为探究潜在致病机制，研究人员构建了Rpe65 p.Pro467Ala敲入小鼠模型。纯合突变小鼠不仅表现出光感受器外节变性，还出现神经节细胞层（GCL）明显紊乱伴不规则核形态，将RPE65病理扩展至外层视网膜之外。转录组分析揭示光转导基因和神经营养因子Vgf表达下调。免疫荧光证实VGF神经生长因子诱导蛋白（VGF）水平显著降低，主要位于内核层（INL），与GCL异常呈空间相关性。值得注意的是，玻璃体腔注射VGF衍生神经保护肽AQEE-30（每4天一次，持续30天）显著改善GCL结构紊乱，但未拯救光感受器变性，表明存在层特异性神经保护。这些发现证明RPE65缺陷通过损害VGF信号传导破坏内层视网膜结构，揭示了RPE65相关LCA中一个此前未被充分认识的病理维度。AQEE-30对GCL病理的选择性拯救提供了概念验证，表明增强VGF相关通路可能为RPE65相关视网膜病变中保留内层视网膜神经元提供辅助性神经保护策略。

**论文解读：RPE65缺陷通过VGF信号损害内层视网膜结构——来自LCA患者和敲入小鼠模型的证据**

**一、研究背景与问题**

Leber先天性黑矇（LCA）是一组遗传性儿童期发病的视网膜营养不良（RDs），患病率约为1:50,000至1:100,000，以严重视力丧失、夜盲和视网膜功能障碍为特征，常导致儿童早期完全失明。超过10%的LCA病例由RPE65基因突变引起，该基因编码视网膜色素上皮（RPE）中视觉循环的关键酶。RPE65在将全反式视黄醇酯转化为11-顺式视黄醛中起核心作用，这是视紫红质再生和光感受器功能维持的关键步骤。在Rpe65基因敲除小鼠中，RPE65功能缺失导致视黄醇循环中断，引起光感受器变性和严重视觉损伤。人类中已鉴定出超过100种RPE65突变与LCA相关。然而，中国人群中RPE65突变谱及其表型特征仍缺乏充分描述。此外，传统观点认为RPE65相关病理主要局限于外层视网膜，其内层视网膜受累机制长期未获阐明。既往研究虽提示RPE65功能障碍可能波及内层视网膜神经元，但具体分子机制仍不明确。本研究旨在鉴定一个携带新型复合杂合RPE65变异（p.Glu399*/p.Pro467Ala）的中国家系，并利用敲入小鼠模型深入探究该突变对内层视网膜结构的影响及其潜在信号通路，为LCA的病理机制和治疗策略提供新见解。

**二、研究内容与主要发现**

研究人员鉴定出两名中国男性同胞（分别为14岁和5岁）患有LCA，携带RPE65基因复合杂合变异（p.Glu399*/p.Pro467Ala），表现为夜盲、视力差以及分布于整个视网膜的白色斑点状病变。其中p.Glu399*变异为文献中未曾报道的新变异，p.Pro467Ala在人类中曾有报道但其体内直接致病作用尚不清楚。为探究p.Pro467Ala的病理机制，研究人员构建了携带该变异的Rpe65 p.Pro467Ala敲入小鼠模型（C57BL/6J背景，采用CRISPR/Cas9介导的同源定向修复技术）。纯合突变小鼠在12周龄时表现出显著的光感受器外节（OS）、外核层（ONL）、外丛状层（OPL）和内核层（INL）厚度减少，更重要的是，神经节细胞层（GCL）出现明显紊乱，表现为不规则核形态和局部细胞排列丧失。转录组分析显示，突变小鼠视网膜中多个光转导相关基因（如Gngt2、Pde6h、Pde6c、Cnga3、Guca1a、Gnat2等）以及神经营养因子基因Vgf表达显著下调。免疫荧光染色证实VGF蛋白水平在突变视网膜中显著降低，信号主要定位于内核层（对应Müller胶质细胞胞体），并在围绕GCL的星形胶质细胞突起中弱表达。这一空间分布与GCL结构异常相关，提示胶质来源的VGF信号以非细胞自主方式维持内层视网膜完整性。进一步的拯救实验中，研究人员对8周龄纯合突变小鼠每4天玻璃体腔注射一次VGF衍生神经保护肽AQEE-30（50 μM，2 μL/眼），持续30天。苏木精-伊红（H&E）染色显示，AQEE-30治疗显著改善了GCL的结构紊乱，但未能拯救光感受器外节和ONL的变性，表明其神经保护作用具有层特异性。该研究明确证明了RPE65缺陷通过损害VGF信号传导破坏内层视网膜结构，揭示了一个此前被忽视的病理维度，并提供概念验证：增强VGF相关通路可作为保存RPE65相关视网膜病变中内层视网膜神经元的辅助性神经保护策略。

**三、主要技术方法**

本研究采用了以下关键技术方法：（1）全外显子测序（WES）结合Sanger测序验证，鉴定并确认RPE65复合杂合变异的遗传模式和分离规律；（2）基于CRISPR/Cas9的同源定向修复（HDR）技术构建Rpe65 p.Pro467Ala敲入小鼠模型（C57BL/6J背景，经Cre重组酶切除新霉素抗性基因盒，回交超过8代）；（3）视网膜组织学分析，包括甲苯胺蓝染色和H&E染色，结合ImageJ软件对各视网膜层厚度进行盲法形态计量学测量；（4）转录组测序（RNA-seq，Illumina NovaSeq 6000平台）结合生物信息学分析（差异表达基因鉴定、GO和KEGG通路富集）；（5）定量实时聚合酶链反应（qPCR）验证关键基因表达；（6）免疫荧光染色（共聚焦显微镜）检测VGF蛋白定位和表达水平；（7）玻璃体腔注射AQEE-30肽进行药物干预实验。样本来源包括来自长沙妇幼保健院的家系患者外周血，以及上海南方模式生物科技有限公司构建的敲入小鼠。

**四、研究结果**

**1. RPE65 p.Glu399*/p.Pro467Ala复合杂合变异与夜盲和视网膜变性相关**
两名兄弟（14岁和5岁）均表现为夜盲。WES显示父母各携带一个RPE65突变（一方携带p.Glu399*，另一方携带p.Pro467Ala），两兄弟均遗传了两个变异，形成复合杂合基因型。与典型卵黄样黄斑营养不良不同，患者表现为弥漫性白色斑点状病变，这一模式与Rpe65rd12小鼠模型中观察到的表型相似，但分布和临床背景不同。患者还表现出广泛的光感受器和内层视网膜功能障碍。

**2. Rpe65 p.Pro467Ala纯合突变小鼠表现出GCL紊乱**
12周龄纯合突变小鼠视网膜甲苯胺蓝染色显示，光感受器OS、ONL、OPL和INL厚度显著减少。值得注意的是，GCL出现紊乱，表现为不规则核形态和受影响区域中实性、细长的异常核。形态计量学分析证实多个视网膜层厚度显著下降。

**3. Rpe65 p.Pro467Ala小鼠GCL中VGF信号降低**
转录组和qPCR分析显示，突变视网膜中多个与视网膜功能相关的基因（包括Vgf、Cndp3、Gngt2、Pde6h、Pde6c、Cnga3、Guca1a和Gnat2）表达显著下调。免疫荧光染色证实突变视网膜中VGF蛋白水平显著降低，信号主要位于内核层（对应Müller胶质细胞胞体），并在GCL周围的星形胶质细胞突起中弱表达。这种胶质来源VGF的减少伴随GCL结构异常，提示VGF信号在维持内层视网膜完整性中发挥非细胞自主作用。

**4. VGF肽AQEE-30缓解Rpe65 p.Pro467Ala小鼠的GCL表型**
对8周龄纯合突变小鼠进行玻璃体腔注射AQEE-30（50 μM，2 μL/眼，每4天一次，共30天）后，H&E染色显示AQEE-30治疗显著改善了突变小鼠GCL的结构紊乱，但未影响光感受器变性。这表明增强VGF相关信号可为内层视网膜提供营养支持，即使VGF不直接表达于视网膜神经节细胞（RGCs）。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，RPE65在类视黄醇代谢、光感受器层维持、视杆细胞功能、视紫红质磷酸化和视锥细胞存活中发挥关键作用。既往研究显示， intrinsically photosensitive retinal ganglion cells (ipRGCs) 在很大程度上不受RPE65消融的影响，因为黑视蛋白依赖的光循环独立于经典视觉类视黄醇循环。本研究中，Rpe65 p.Pro467Ala纯合小鼠GCL的间歇性紊乱可能涉及包括ipRGCs在内的RGC亚群。患者眼底白色斑点状病变可能反映继发于神经元功能障碍的局灶性内层视网膜萎缩或胶质增生。与Takeuchi等人一致，免疫染色证实VGF主要表达于Müller胶质细胞（INL）和星形胶质细胞，而非RGC胞体本身。GCL病理可能反映胶质来源的VGF肽（如AQEE-30）扩散至邻近神经元的神经营养支持丧失。这种非细胞自主机制解释了为何玻璃体腔注射AQEE-30（尽管RGC中VGF表达极少）能显著改善GCL紊乱。与Métrailler等人在Rpe65?/?小鼠中报道的ERK1/2激活和GFAP上调不同，本研究敲入模型揭示了GCL核结构的原发性紊乱，这可能反映了p.Pro467Ala变异与完全RPE65消融的突变特异性效应差异，并提示VGF信号缺陷是RPE65相关疾病中内层视网膜病理的先前未被识别的贡献因素。研究局限性方面，患者携带复合杂合基因型（p.Glu399*/p.Pro467Ala）而非p.Pro467Ala纯合，p.Glu399*无义等位基因预计触发无义介导的mRNA降解导致RPE65蛋白完全缺失，而p.Pro467Ala可能允许蛋白表达但异构水解酶活性受损，这种等位基因组合可能产生比纯合错义状态更严重的视觉循环缺陷。但研究人员特意选择纯合错义敲入模型以剖析p.Pro467Ala这一意义未明变异的病理机制，避免无效等位基因的混杂效应。未来构建复合杂合小鼠将有助于完全模拟人类基因型。AQEE-30的层特异性神经保护作用与其空间表达模式精确吻合：VGF主要表达于Müller胶质细胞和GCL周围星形胶质细胞突起，而光感受器中不表达。机制上，AQEE-30可能通过非细胞自主营养支持发挥作用：从内层视网膜胶质细胞分泌后局部扩散至邻近神经节细胞和无长突细胞，激活促生存信号通路（如PI3K/AKT），维持核结构和细胞排列。相反，光感受器变性源于细胞自主的生化缺陷——RPE中异构水解酶活性受损导致无法再生11-顺式视黄醛。由于AQEE-30不能恢复视觉发色团循环或纠正原发性酶缺陷，因此无法阻止光感受器不可避免的丧失。这种二分法强调：靶向内层视网膜信号通路的神经保护肽可作为RPE65相关LCA中保存神经节细胞功能的辅助治疗，但必须与解决根本原因的方法（如voretigene neparvovec基因治疗）联合以实现全面的视网膜拯救。

研究结论：RPE65缺陷通过损害VGF信号传导破坏内层视网膜结构，揭示了RPE65相关LCA中一个此前未被充分认识的病理维度。AQEE-30对GCL病理的选择性拯救提供概念验证，表明增强VGF相关通路可为RPE65相关视网膜病变中保留内层视网膜神经元提供辅助性神经保护策略。该研究发表于《Visual Neuroscience》。