先兆子痫中胎盘PRDX2-VEGFA/ENG网络的重构将氧化应激与血管生成失败联系起来：一项多队列转录组研究

《Computational Biology and Chemistry》：Placental PRDX2-VEGFA/ENG network rewiring links oxidative stress to angiogenic failure in preeclampsia: a multi-cohort transcriptomic study

　　•五个PE胎盘GEO队列共检测出801个差异表达探针•PRDX2-ENG和PRDX2-VEGFA呈现最强的PE相关负相关性•通过delta-r值量化了12对基因间的PE特异性网络重连情况•17基因逻辑分析组的PE诊断AUC值为0.781（CV-AUC为0.729）•CAT和IL13被确定为同等重要的转录组核心基因（度数为11）

引言
子痫前期是产科医学中最具挑战性且后果严重的并发症之一。根据国际妊娠高血压研究学会的定义，子痫前期是指妊娠20周后出现新发高血压（收缩压≥140毫米汞柱或舒张压≥90毫米汞柱），并伴有蛋白尿或靶器官功能障碍的表现。全球约有5%-8%的妊娠会出现子痫前期，它导致了全球约10%-15%的孕产妇直接死亡[1]、[2]。除了直接的临床紧急状况外，子痫前期还是长期心血管风险的预警信号：曾患子痫前期的女性，其一生中患高血压的风险比正常妊娠女性高3-4倍，患缺血性心脏病的风险高2倍，患中风的风险也高2倍[3]。尽管经过数十年的深入研究，目前唯一确定的治疗方法仍是娩出胎盘，但这往往会导致医源性早产以及随之而来的新生儿并发症。这一根本性的限制凸显出迫切需要更深入地了解子痫前期的病理生理机制，以及开发能够实现早期检测、风险分层和动态监测的可靠分子生物标志物。

目前广泛接受的子痫前期两阶段模型认为，妊娠早期的滋养层侵袭功能受损以及螺旋动脉重塑异常（第一阶段）会导致胎盘缺氧-再灌注损伤，进而引发以内皮功能障碍、高血压和多器官受累为特征的全身性母体综合征（第二阶段）[4]。在这一系列病理过程中，胎盘作为内分泌器官起着关键作用，它会向母体循环中释放各种血管活性物质、促炎因子和抗血管生成因子。目前已有大量研究致力于探究将胎盘缺氧损伤与全身性血管功能障碍联系起来的具体分子机制，现有证据表明存在三个相互关联的病理轴：(1)氧化应激与抗氧化能力不足；(2)细胞因子失衡与免疫耐受异常；(3)血管生成功能失调。至关重要的是，这些通路并非孤立存在，大量证据表明它们构成了一个紧密相连的网络，但目前尚未在多个独立队列中全面揭示其在转录组层面的相互作用机制。

氧化应激是指活性氧生成与抗氧化防御之间的失衡，在子痫前期的病理机制中处于核心地位[5]。在缺氧的子痫前期胎盘中，线粒体电子传递功能异常、黄嘌呤氧化酶活性升高以及NADPH氧化酶表达上调，共同导致过量的超氧阴离子自由基和过氧化氢产生。这些物质会超出细胞的抗氧化系统能力，包括超氧化物歧化酶（SOD1/2/3）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、过氧化物还原酶（PRDX1-6）以及硫氧还蛋白系统（TXN/TXNRD1）[6]。Nrf2这一关键的转录因子（由NFE2L2编码）可通过抗氧化反应元件调控上述抗氧化酶的表达，但研究表明在子痫前期胎盘中，Nrf2的功能可能受到KEAP1介导的降解或表观遗传沉默的影响而受损[7]。除了通过脂质过氧化、蛋白质氧化和氧化DNA损伤（以8-OHdG作为指标）直接造成细胞损伤外，活性氧还可作为第二信使，激活NF-kappaB、MAPK和JAK-STAT等下游信号通路，从而在氧化损伤与细胞因子失衡之间建立生化联系[8]。正是由于这一关键作用，氧化应激相关基因不仅可作为疾病严重程度的生物标志物，还可能属于病理网络中的核心节点，而本研究正是针对这一假设展开探索。

正常妊娠的免疫环境呈现出以Th2/Treg细胞为主的微妙耐受状态，这种状态有助于胎儿半同种异体移植的实现[9]。而子痫前期则会严重破坏这种免疫特权。来自胎盘活检、蜕膜组织以及母体血清的多种证据均表明：(1)促炎细胞因子水平升高，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8（CXCL8）和IFN-γ；(2)抗炎因子及耐受形成相关因子水平下降，包括IL-4、IL-10、IL-13和TGF-β1；(3)JAK-STAT信号通路被激活，尤其是STAT1和STAT3；(4)NF-kappaB驱动的炎症相关转录程序被上调[10]、[11]。这种细胞因子平衡的改变会带来多重后果：由于TNF-α和IL-1β的作用，全身性内皮细胞会被激活；由于TGF-β信号传导受阻，滋养层细胞的侵袭功能会受损；同时蜕膜中的NK细胞和巨噬细胞也会被进一步激活。值得注意的是，多种细胞因子可直接调控血管生成过程：IFN-γ可抑制VEGFA的表达并促进抗血管生成因子CXCL10的生成；IL-13可影响TGF-β介导的血管重塑；CCL5则参与NK细胞介导的螺旋动脉重塑[12]。这些多方面的效应使得细胞因子失衡成为子痫前期中免疫功能障碍与血管功能衰竭相互关联的关键环节。

在所有与子痫前期相关的分子机制中，血管生成功能失调是最具有临床验证价值的途径，其特点为循环中可溶性fms样酪氨酸激酶1（sFlt-1）和可溶性内皮凝集素（sENG）水平过高，同时胎盘生长因子（PlGF）和VEGFA的水平则被抑制[13]。sFlt-1/PlGF比值已被多个国家作为子痫前期的诊断和预后生物标志物，PROGNOSIS试验更是证明了在妊娠20周后，该比值在两周内预测子痫前期的AUC值可超过0.90[14]。然而，导致sFlt-1释放的胎盘分子机制仍不完全清楚。内皮凝集素（ENG/CD105）是表达在胎盘滋养层细胞和内皮细胞上的TGF-β共受体，它会被蛋白酶水解为可溶性形式，进而干扰TGF-β介导的血管稳态维持[15]。作为胎盘血管生成的主要驱动因子，VEGFA在子痫前期会被过量的sFlt-1结合，从而导致子宫胎盘缺血。缺氧诱导因子1-α（HIF1A）及其同源物EPAS1（HIF-2α）会在胎盘缺氧时协同调控VEGFA和ENG的转录，从而形成胎盘氧感应与血管生成信号之间的反馈循环[16]。因此，了解氧化应激如何在转录组层面调控这些血管生成相关因子，不仅具有重要的科学意义，也有助于指导临床实践。

高通量转录组学技术的发展极大地提升了我们从分子层面研究复杂疾病的能力。自2006年以来，已有众多关于子痫前期胎盘的全基因组表达谱研究被存入NCBI基因表达组数据库（GEO）公共资源库，这些研究涵盖了多种子痫前期亚型、不同妊娠时期以及不同的检测平台，共计分析了数百例病例和对照样本[17]。与单队列研究相比，整合这些独立的数据库具有诸多优势：能够更有效地检测那些虽幅度较小但具有生物学意义的基因表达变化；可以通过不同人群、不同平台和不同子痫前期亚型的数据相互验证研究结果；还能帮助评估在生物多样性背景下分子特征的一致性。尽管拥有如此丰富的数据资源，但目前还没有任何研究系统性地应用多数据库整合方法来分析氧化应激与细胞因子基因网络在子痫前期中的相互作用，也没有研究评估过包含氧化应激、细胞因子和血管生成相关基因的复合检测panel的诊断性能。而这正是本研究要解决的核心问题。

开展这项研究的动机源于三个相互关联的科学和临床需求。首先，人们已经认识到，子痫前期中的氧化应激和细胞因子失衡并非独立的病理现象，而是彼此之间存在机械联系的通路，但目前尚未在多个独立队列中通过转录组分析手段量化这种分子间的相互作用。其次，临床上亟需经过验证的多基因生物标志物panel，以便用于动态血清学监测。鉴于子痫前期的发病往往迅速且难以预测，且其严重程度与分子水平的失衡程度密切相关，这一需求显得尤为重要。第三，随着公共转录组数据的日益丰富，如果能够对这些数据进行合理整合，就能获得足够的统计能力，从而识别出稳定的分子特征。本研究正契合“生殖道疾病整合多组学与转录组学分析”特刊的目标，为生殖医学领域这一亟待解决的临床问题提供了基于生物信息学的解决方案。通过共表达网络分析识别出核心基因，并将其作为潜在的血清生物标志物进行验证，最终有望为开发基于panel的液体活检方法用于子痫前期的风险分层和临床监测提供理论依据。

因此，本研究的具体目标包括：(1) 对包含296份胎盘样本的五个独立子痫前期转录组数据集进行差异基因表达分析；(2) 对氧化应激、细胞因子和血管生成相关通路进行通路富集分析；(3) 揭示子痫前期胎盘中氧化应激与细胞因子/血管生成相关基因表达之间的定量关联关系；(4) 通过ROC分析结合交叉验证，评估单个基因panel和复合基因panel在区分子痫前期患者中的诊断性能；(5) 通过共表达网络分析和类似WGCNA的模块检测方法，识别出可作为血清动态监测候选指标的核心基因。

数据集获取与研究设计
本研究属于一项生物信息学分析，所使用的数据均为来自NCBI基因表达组数据库（GEO；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）的公开、去标识化的基因表达数据，无需获得伦理审批。根据预先设定的标准，共选择了五个GEO数据集：(1) 数据来源于人类胎盘组织；(2) 数据为子痫前期组与正常血压对照组之间的直接对比；(3) 基于微阵列技术进行基因表达定量分析；(4) 具有完整的临床和表型信息。

数据集概览与差异表达特征
共有296份人类胎盘转录组数据被纳入本研究的五个GEO数据集进行分析（见表1），这是目前针对子痫前期氧化应激、细胞因子和血管生成相关通路的最为全面的五队列、多平台转录组分析。子痫前期组包含143份样本，涵盖了重度子痫前期、早发性子痫前期、晚发性子痫前期以及通过分子方法定义的各类子痫前期亚型，而对照组则包含153份正常妊娠女性的胎盘样本。选择如此多样化的子痫前期表型样本是有意为之的。

讨论
本研究最具创新性的发现是确定了PRDX2作为连接子痫前期胎盘中氧化应激与血管生成功能障碍的分子核心节点，而此前尚未有研究通过差异共表达分析在多个独立子痫前期队列中系统地量化这种关联。PRDX2与ENG（r = -0.777）以及VEGFA（r = -0.697）之间存在较强的负相关性，而在子痫前期胎盘中这种相关性更为显著（Δr分别为-0.119和-0.236）。

局限性与未来研究方向
本研究也存在一些局限性，需要坦诚加以说明。首先，所选的17基因检测panel是基于现有文献资料和Illumina探针的可用性预先确定的，并非通过无偏见的全基因组筛选得出的。由于当时的计算环境中缺乏完整的GPL注释数据库，采用这种方法是一种现实需求，但这也意味着可能有一些重要的与子痫前期相关的基因被遗漏。未来的研究应当……

结论
本研究通过对五个独立GEO数据集中的296份人类胎盘样本进行分析，全面阐述了子痫前期中氧化应激防御、细胞因子信号传导以及血管生成调控之间的共表达关系。我们的分析得出了四个具有实际应用价值的结论。首先，子痫前期中氧化应激与血管生成功能相互关联的核心转录组特征与PRDX2、ENG、VEGFA密切相关。

资金支持
本研究得到了湖南中医药大学校级科研基金项目——熊娟老师的资助，项目编号为ZYYDX201753。

作者贡献声明
刘鹏：负责数据可视化及软件操作工作；乔江：负责文章的审阅与编辑以及结果验证工作；谭振宇：负责文章的审阅与编辑、数据可视化以及结果验证工作；雷蕾：负责研究项目的整体监督、资源协调、项目管理、资金申请以及研究概念的构思工作；熊娟：负责撰写文章初稿、开展实验研究、进行正式数据分析、数据整理以及研究概念的构思工作。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
作者感谢那些最初生成并将转录组数据存入NCBI GEO的科研人员，同时也感谢NCBI GEO团队对这一公共资源的大力维护。

机构审查委员会声明
本研究仅分析了存储在NCBI基因表达组数据库中的公开、去标识化的转录组数据，未收集任何新的患者数据，因此无需经过机构审查委员会的审批。

知情同意声明
本研究中使用的所有数据均为公开数据，其原始收集过程均已遵循相应的知情同意程序。

熊娟|刘鹏|乔江|谭振宇|雷蕾