利用自然感受态对惰性乳杆菌进行遗传操作

《Applied and Environmental Microbiology》：Utilizing natural competence to genetically manipulate Lactobacillus iners

　　

健康的女性阴道微生物群通常由一种乳杆菌属（Lactobacillus）物种主导：惰性乳杆菌（L. iners）、卷曲乳杆菌（L. crispatus）、詹氏乳杆菌（L. jensenii）或加氏乳杆菌（L. gasseri）。惰性乳杆菌是全球最普遍的阴道微生物，是阴道乳杆菌中最挑剔的，拥有最小的基因组，并产生较少的乳酸（仅L-异构体）。惰性乳杆菌对细菌性阴道病（bacterial vaginosis, BV）的保护作用也较弱，并且独特地编码一种胆固醇依赖性细胞溶素（cholesterol-dependent cytolysin），即惰性溶素（inerolysin），表明它可能是一种机会致病菌（pathobiont）。尽管惰性乳杆菌在超过十亿女性的健康中发挥着核心作用，但其生物学特性仍然知之甚少，部分原因是缺乏基因编辑工具。在此，研究人员报告了惰性乳杆菌具有自然感受态（natural competence），并且可以轻易地被外源DNA转化。利用自然感受态，研究人员破坏了编码惰性溶素的iny基因，以及编码感受态菌毛（competence pilus）ATP酶组分的comGA基因。这两个基因的破坏均使用PCR组装的DNA片段完成，该片段包含一个耐药基因盒（tetM或ermB），两侧为与惰性乳杆菌染色体同源的约2 kb区域。研究人员进一步证明，comGA对于惰性乳杆菌的转化是必需的。利用体外生成的DNA模板在惰性乳杆菌中快速进行靶向缺失的能力，为探究这些重要阴道细菌的遗传学和生理学提供了一种直接且亟需的方法。重要性：据研究人员所知，本研究描述了第一种对惰性乳杆菌（人类阴道微生物群中最普遍的细菌）进行遗传操作的方法。这项工作为快速开发遗传工具以探索惰性乳杆菌在阴道微生物组背景下的生理学，并可能改变其作为益生菌的特性铺平了道路。

**研究背景与问题**
女性阴道微生物群通常由乳杆菌属（*Lactobacillus*）物种主导，其中惰性乳杆菌（*L. iners*）是全球最普遍的阴道微生物。尽管其基因组最小（约1.3 Mbp）、营养需求苛刻，且仅产生L-异构体乳酸，但它在细菌性阴道病（bacterial vaginosis, BV）发作时数量不受影响，并编码一种独特的胆固醇依赖性细胞溶素——惰性溶素（inerolysin），提示其可能为弱保护性机会致病菌。然而，由于缺乏遗传编辑工具，对该菌的生物学特性（如基因调控、致病机制）知之甚少。此前尝试通过电穿孔、接合及自然感受态进行基因编辑均未成功，而其他阴道乳杆菌（如卷曲乳杆菌*L. crispatus*、加氏乳杆菌*L. gasseri*）已有遗传工具报道。因此，开发一种简便、高效的遗传操作方法是解析*L. iners*生理功能、探究其在BV发生及益生菌改造中的关键作用的迫切需求。本研究发表于《Applied and Environmental Microbiology》。

**研究内容与结论**
研究人员通过生物信息学分析发现，*L. iners*菌株普遍编码自然感受态相关基因（如*comG*, *comE*, *comF*等），并利用外源基因组DNA（genomic DNA, gDNA）及PCR组装片段成功实现了*L. iners*的遗传转化。通过破坏惰性溶素编码基因*iny*及感受态菌毛ATP酶编码基因*comGA*，证实了自然感受态的可操作性，并证明了*comGA*对转化过程至关重要。该研究首次建立了*L. iners*的遗传操作体系，为研究其生物学及阴道微生态提供了工具，并可能推动其作为益生菌的改造。

**主要技术方法**
研究人员从肯尼亚女性宫颈阴道分泌物中分离出6株*L. iners*菌株（NVM020S14、NVM025S01等），并利用其基因组分析及自然感受态基因的同源性比对（BLASTP、TBLASTN）。通过PCR扩增获得约2 kb的同源臂，结合吉布森组装（Gibson assembly）构建了含耐药基因盒（*tetM*或*ermB*）的线性DNA片段，用于靶向基因敲除。转化效率通过菌落计数（CFU）及PCR验证，并利用牛津纳米孔（Oxford Nanopore）测序数据鉴定DNA甲基化模式。

**研究结果**
1. **L. iners competence genes**：对所有84个完整的*L. iners* RefSeq基因组分析显示，自然感受态基因（如*coiA*, *comC*, *comG*等）在所有菌株中普遍存在且高度保守，仅一个宏基因组组装缺失*comG*操纵子。与枯草芽孢杆菌（*Bacillus subtilis*）、嗜热链球菌（*Streptococcus thermophilus*）等革兰氏阳性菌相比，*L. iners*的感受态蛋白序列相似性低于40%，但操纵子结构具有同线性。

2. **L. iners can be transformed with genomic DNA**：利用携带Tn916整合性接合元件（含*tetM*和/或*ermB*）的供体菌株gDNA，转化红霉素敏感的受体菌株（NVM196S18、NVM210S01），成功获得耐药菌落，转化效率约为10^-4。添加DNase显著降低或消除转化，证实裸DNA为转化底物。PCR验证显示，转化子保留了受体菌株的特异性基因（如N6-甲基转移酶），并获得了*ermB*基因。

3. **L. iners inerolysin knockout using PCR fragments**：通过吉布森组装构建*iny*基因敲除片段（含*ermB*），成功转化NVM196S18、NVM210S01及NVM076S08三株菌株，转化效率约为10^-5至10^-4。对照实验显示，NVM076S08在gDNA转化中未成功，但使用同源片段时成功，提示同源序列变异或DNA修饰影响转化效率。

4. **comGA is required for L. iners competence**：利用*comGA*敲除片段（含*tetM*）转化NVM076S08，获得*comGA*突变株。随后用*iny*::*ermB*片段转化该突变株，未获得红霉素抗性转化子，证实*comGA*是转化所必需的。反向顺序（先敲除*iny*再敲除*comGA*）成功获得双敲除突变株，验证了实验稳健性。

5. **DNA restriction-modification systems and methylations across L. iners isolates**：通过MicrobeMod预测及牛津纳米孔测序数据，发现所有菌株均含保守的II型限制修饰（restriction-modification, RM）系统（靶向GCGC基序），并存在I型或III型RM系统变异。转化效率高的菌株（如NVM196S18、NVM210S01）缺乏III型RM系统，且甲基化修饰（如5mC、6mA）与预测的甲基转移酶特异性部分对应。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次证实*L. iners*的自然感受态及其用于靶向基因修饰的可行性。感受态基因在菌株间高度保守，但*comG*操纵子3′端编码小菌毛亚基的区域存在变异，可能受表面暴露的选择压力。不同菌株转化效率的差异可能与RM系统、DNA甲基化及营养条件（如SLIM培养基中游离氨基酸的重要性）有关。此外，*L. iners*仅编码一个Ssb蛋白（SsbA），而其他革兰氏阳性菌有两个，这可能影响重组效率。研究结论翻译如下：这里呈现的结果将为更好地理解*L. iners*的生物学特性提供一个宝贵的工具箱。利用其自然感受态进行遗传操作，将有助于揭示哪些基因和基因组网络可能影响BV菌群失调的转变或预防，以及理解哪些基因对宿主黏附和相互作用至关重要。