综述：水稻孕穗期冷胁迫：对花药发育、激素调控及耐冷遗传机制的影响

《Current Plant Biology》：Cold Stress at the Booting Stage in Rice: Impacts on Anther Development, Hormonal Regulation, and Genetic Mechanisms of Tolerance

　　

孕穗期冷胁迫严重损害水稻生殖器官，尤其破坏绒毡层功能与花粉发育，导致结实率下降及显著产量损失，是制约水稻生产的关键逆境因子。碳水化合物代谢、活性氧（reactive oxygen species, ROS）稳态及激素介导的信号通路，包括脱落酸（abscisic acid, ABA）、赤霉素（gibberellins, GA）、生长素（auxin, IAA）、细胞分裂素（cytokinins, CKs）、茉莉酸（jasmonic acid, JA）和乙烯（ethylene, ET），在调控生殖期耐冷性中发挥关键作用。本综述系统阐述了冷胁迫对花药发育的影响，重点聚焦绒毡层-小孢子互作，以及代谢、氧化还原与激素途径的协同调控对低温下花粉育性的决定作用。研究人员进一步总结了耐冷性的遗传架构，包括主效数量性状位点（quantitative trait loci, QTLs）、已克隆基因及调控因子，如CTB4a、CTB2、CTF1和qCTB7，这些因子通过多样分子机制贡献于生殖期耐冷性。此外，文章讨论了赋予跨阶段耐冷性的基因及其在水稻育种中的潜在应用，并指出了当前知识空白，展望了整合遗传学、生理学及多组学策略以提升生殖期耐冷性的未来方向。通过系统梳理上述进展，本综述为培育低温胁迫下具有稳定育性与生产力的气候韧性水稻品种提供了理论框架。

1. 1.
   引言
   水稻（Oryza sativa L.）作为全球重要主粮作物，支撑着超过半数世界人口的粮食安全。其包含两个主要亚种：籼稻（indica）与粳稻（japonica），前者主要种植于温暖气候区，后者因具备更强的耐冷性而广泛分布于温带及高海拔地区。从稻米品质来看，粳稻在整精米率、垩白度、透明度及支链淀粉含量上通常优于籼稻，且2001至2019年间全球人均粳稻消费量呈显著上升趋势，反映出消费偏好的转变。随着水稻种植区向温带、高海拔及气候波动区扩展，加之气候变率增加导致冷事件发生的时空不确定性增强，提升生殖期耐冷性已成为保障水稻生产力与粮食安全的核心育种目标。在水稻全生育期中，孕穗期是对低温最为敏感的关键瓶颈期，此阶段花粉母细胞减数分裂、绒毡层发育、小孢子形成及花粉成熟过程极易受低温干扰，常引发花粉不育、花药开裂受阻及结实率下降，且此类生殖损伤具有不可逆性，即使后续营养生长恢复也难以弥补产量损失。我国粳稻种植面积已超过1000万公顷，但东北及云贵高原等主产区孕穗期频发的低温冷害，年均造成300-500万吨产量损失。鉴于冷害的持续性威胁，培育孕穗期耐冷水稻品种已成为保障产量稳定的战略优先方向。然而，受限于生殖期胁迫表型鉴定的复杂性，目前关于孕穗期耐冷机制的研究仍相对滞后，已鉴定并验证的功能基因数量有限，亟需加强耐冷基因与QTL的挖掘及功能解析以支撑分子育种实践。
2. 2.
   孕穗期冷胁迫对水稻花药发育的影响
   水稻雄配子体发育涉及开花时间调控、花药壁建成、花药开裂、花粉活力维持、花粉管伸长及授粉受精等一系列复杂过程，其中花药是对低温最为敏感的组织之一。研究表明，水稻花粉母细胞在四分体至早期单核小孢子阶段的低温敏感性显著高于减数分裂期，此阶段的低温胁迫会破坏绒毡层程序性降解，导致绒毡层细胞异常膨大，阻断营养物质向发育中小孢子的运输，进而干扰碳水化合物代谢，最终引致花粉成熟受阻、空壳率上升及结实率下降。Yamamori等通过对13份水稻基因型的孕穗期低温处理发现，冷敏感品种即使未表现出明显的花药形态异常，其花粉不育率仍显著升高，提示绒毡层缺陷并非导致不育的唯一原因。解剖学分析进一步揭示了低温诱导的多重发育异常：花药室发育不全导致花药弯曲皱缩、无活力花粉形成；花药室塌陷伴随小孢子与绒毡层退化、表皮细胞脱离破坏细胞间连接；以及花药形态完整但蔗糖合成与积累不足，而蔗糖作为花药外源供给的关键碳源对花粉发育至关重要，其缺乏会严重阻碍花粉粒成熟并导致高不育率。此外，低温强度与持续时间是决定冷害程度的关键因素，15-19°C的低温常诱导幼嫩小孢子期花粉不育，而12-15°C的长时间暴露则易引发严重的穗粒不育，且不同基因型对低温的耐受阈值存在显著基因型×环境互作。值得注意的是，孕穗期冷胁迫会显著抑制花药伸长，而花药长度与耐冷性呈正相关，因此胁迫下的花药长度可作为评价水稻耐冷性的可靠形态指标。
3. 3.
   水稻生殖期耐冷性的调控机制
   孕穗期低温胁迫通过干扰可溶性糖转运、活性氧稳态及激素平衡等关键生理代谢途径，导致水稻结实率与产量显著下降，这些过程的协同调控构成了生殖期耐冷性的核心机制。

3.1 冷胁迫下碳水化合物代谢与花粉发育

可溶性糖在植物冷胁迫响应中兼具碳源、能量底物及胁迫适应调节因子的多重功能。孕穗期蔗糖的正常转运与代谢是维持绒毡层功能及小孢子发育的基础。低温胁迫会破坏花药内碳水化合物的分配格局，其核心机制在于基因转录与蛋白质翻译的解偶联。低温诱导绒毡层细胞异常增殖，阻碍蔗糖从绒毡层向发育中小孢子的运输。花药特异性细胞壁转化酶基因INV4编码的酶蛋白负责将蔗糖水解为葡萄糖与果糖，而单糖转运蛋白基因MST8和MST7编码的转运蛋白则介导己糖跨膜运输。低温下INV4的转录显著下调导致功能性转化酶蛋白匮乏，同时MST8/7的表达抑制限制了转运蛋白丰度，致使蔗糖在绒毡层过量积累并引发异常液泡化，而小孢子因缺乏己糖供应无法合成淀粉，最终导致花粉活力下降与穗粒不育。外源蔗糖施用可通过改善碳水化合物供应、促进花粉淀粉积累缓解冷诱导的不育现象，印证了糖代谢在耐冷性中的关键作用。

3.2 冷胁迫下ROS稳态与绒毡层发育

孕穗期冷胁迫会破坏水稻花药细胞稳态，诱导超氧阴离子（O₂^·-）、过氧化氢（H₂O₂）及羟基自由基等ROS积累。过量ROS会引发脂质过氧化、蛋白质损伤及DNA断裂，最终导致绒毡层细胞死亡。绒毡层过早程序性细胞死亡（programmed cell death, PCD）会阻断营养物质向小孢子的转运，是低温下花粉败育与结实率下降的重要原因。为维持氧化还原平衡，水稻在冷胁迫下会激活抗氧化防御系统：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）及抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase, APX）等酶促抗氧化剂负责ROS清除，谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）、愈创木酚过氧化物酶（guaiacol peroxidase, POD）、单脱氢抗坏血酸还原酶（monodehydroascorbate reductase, MDHAR）及脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase, DHAR）等参与 redox 循环维持；抗坏血酸、谷胱甘肽、α-生育酚、类胡萝卜素及类黄酮等非酶促抗氧化剂则协同增强ROS清除能力。耐冷基因型通常能维持或提升上述抗氧化酶的活性及非酶促抗氧化剂的积累，从而保障绒毡层细胞存活与花粉育性。ROS稳态失衡与绒毡层发育异常及花粉形成受阻密切相关，过量ROS会加速或失调绒毡层PCD，进而破坏小孢子发育。此外，质膜定位的ATP合酶亚基CTB4a通过维持低温下细胞ATP稳态，直接影响能量依赖的糖转运及气孔调控以防止幼穗脱水；囊泡运输组分COG3及转录调控因子WRKY53等则协同维持细胞结构完整性，阻止冷胁迫诱导的绒毡层过早降解，这些遗传因子共同构成了保护糖供应与绒毡层健康的调控网络。

3.3 冷胁迫下花药发育的激素调控

冷胁迫会引致水稻花药内复杂的激素失衡，显著影响生殖发育与耐冷性，ABA、GA、IAA、CKs、JA及ET通过互作网络共同调控低温下的绒毡层存活与花粉发育。

3.3.1 脱落酸（ABA）

冷胁迫下水稻花药中ABA水平显著升高，尤其在冷敏感基因型中更为明显，这源于ABA生物合成基因（如玉米黄质环氧酶基因ZEP1、9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶基因NCED3）的上调及ABA降解基因（ABA8ox1、ABA8ox2）的下调。过量ABA会抑制INV4及糖转运基因MST7、MST8的表达，阻碍蔗糖动员，最终导致花粉败育。ABA信号通过PYR/PYL/RCAR受体蛋白感知，抑制PP2C磷酸酶并激活SnRK2蛋白激酶，进而调控下游转录因子及胁迫响应蛋白，参与氧化还原调控、碳水化合物代谢及生殖发育。尽管OsPYL9、OsPP2C09及SnRK2蛋白在ABA介导的胁迫信号与生殖发育中的作用已被证实，但其在孕穗期冷胁迫下调控绒毡层退化的直接证据仍需验证。ABA信号还与ROS稳态及PCD密切相关，适度ABA积累可激活保护性抗氧化响应，而过量ABA信号则会破坏 redox 平衡，改变绒毡层PCD时序，损害花粉发育。

3.3.2 赤霉素（GA）

GA水平与耐冷性呈正相关。低温下GA生物合成基因（GA20ox3、GA3ox1）表达下调，导致活性GA减少，进而削弱绒毡层功能并延迟PCD，损害花粉育性。外源GA施用（尤其与蔗糖协同）可部分恢复花粉活力与结实率。GA缺乏会导致DELLA蛋白（如SLR1）积累，干扰绒毡层功能与碳水化合物代谢，而TDR、EAT1、PTC1等调控绒毡层PCD及花粉壁形成的关键转录因子对胁迫下的雄育性维持至关重要，解释了GA缺乏与低温下花药成熟异常的相关性。

3.3.3 生长素（IAA）

IAA在花药分化、花粉发育及维管运输中起核心作用。冷胁迫通过抑制YUCCA、PIN及ARF等基因表达降低生殖组织IAA水平，破坏碳水化合物代谢与花药形态建成，加剧不育风险。IAA通过协调绒毡层功能与脂质代谢调控花药角质层及花粉外壁形成，CYP704B2、DPW、DPW2等基因在绒毡层与小孢子中的特异性表达是其功能发挥的基础。尽管IAA对冷胁迫下上述基因的直接调控尚未明确，但冷胁迫会扰乱IAA稳态与运输，如生长素外排载体OsPIN1b功能缺失会显著降低水稻耐冷性，提示低温下向幼穗及花药的生长素运输减少可能限制营养供应并促进花粉败育。

3.3.4 细胞分裂素（CKs）

CKs调控绒毡层功能及早期花粉发育的营养供应。冷胁迫通过抑制IPT生物合成基因及上调CKX降解基因降低穗组织CK水平，负面影响小孢子发生并增加ROS损伤敏感性。水稻中组氨酸激酶受体（OsHKs）、磷酸转移蛋白及B型响应调节因子（OsRRs）组成的双组分CK信号系统参与花序结构、花发育及受精调控，OsRR基因突变会导致花药发育受损与育性下降，CKX活性介导的细胞分裂素稳态维持则影响植株发育与花序性状。虽然CK信号或CKX表达对冷胁迫下绒毡层退化及花粉不育的直接调控证据不足，但冷诱导的细胞分裂素失衡可能增强生殖组织对胁迫的敏感性。

3.3.5 茉莉酸（JA）与乙烯（ET）

JA与ET参与冷胁迫响应，分别通过调控防御反应、ROS信号及PCD发挥作用，其中JA通常促进胁迫适应，而过量ET积累可能加剧冷害与生殖缺陷。JA与ABA信号互作调控抗氧化防御与生殖发育，ABA诱导的ROS积累可作为胁迫适应的信号线索，而JA则参与激活抗氧化酶并维持细胞 redox 平衡，二者协同通过调控ROS清除与绒毡层功能影响花药开裂、花粉活力及育性。JA通过调控脂质代谢与孢粉素生物合成参与花药及花粉壁发育，OsAOC、OsOPR7等JA生物合成基因通过激活MYB与bHLH转录因子调控外壁形成，其功能缺失导致花粉壁缺陷与雄不育。尽管冷胁迫下花药JA生物合成的抑制尚未被直接证实，但JA信号减弱会损害胁迫下的绒毡层发育。ET生物合成与信号在低温下常被诱导，其过量积累可能促进早衰、加速细胞退化并破坏生殖发育，如ET水平升高与水稻胁迫下花丝伸长受阻、花药功能异常及受精成功率下降相关，且ET信号可通过影响ROS产生与抗氧化活性调控细胞 redox 稳态。上述激素间存在协同与拮抗作用，如ABA通常抑制GA与IAA信号，而GA与IAA则协同促进绒毡层发育与花粉成熟，其互作网络通过调控TDR、EAT1、PTC1及OsbHLH142等关键花药调控因子，整合绒毡层PCD、脂质代谢及ROS稳态，最终决定植物在冷胁迫下的育性维持能力。

3.4 冷胁迫下绒毡层-小孢子互作的整合调控

碳水化合物代谢、ROS稳态及激素信号并非独立运作，而是在发育中的花药内形成高度互作的网络，共同调控绒毡层功能与花粉发育。绒毡层作为该网络的核心枢纽，不仅为花粉成熟提供营养、脂质前体及信号分子，还精确调控特定发育阶段的PCD，其功能紊乱会引发花药内多重生理过程的级联失调。碳水化合物供应是维持小孢子发育的基础，低温下INV4、MST7、MST8基因的转录抑制导致细胞壁转化酶及己糖转运蛋白匮乏，阻断己糖动员，造成小孢子碳水化合物供应不足与绒毡层异常膨大。同时，冷诱导的氧化胁迫通过ROS信号调控绒毡层PCD时序，过量ROS会导致PCD过早或失调，破坏营养转运；耐冷基因型则通过高效抗氧化系统将ROS维持在适宜水平，保障绒毡层正常降解与花粉活力。激素信号通过协调发育与胁迫响应通路进一步调控上述过程：ABA积累常伴随ROS产生增加及抗氧化能力抑制，加剧敏感基因型的氧化损伤；GA则通过维持 redox 平衡促进花药正常发育，外源GA可部分恢复育性。上游呼吸爆发氧化酶同源蛋白（Respiratory Burst Oxidase Homolog, RBOH）作为NADPH氧化酶驱动ROS产生，若冷胁迫同时抑制SOD、CAT、APX等清除基因的表达，将导致ROS大量积累。激素途径与 redox 调控紧密偶联，如ABA过量积累可能增强氧化损伤，而GA与JA则通过支持抗氧化能力与发育稳定性提升生殖韧性。TDR、EAT1、PTC1、OsbHLH142及WRKY等转录因子可能是整合激素信号、ROS稳态与绒毡层PCD的关键节点，但其如何整合温度信号与发育程序的分子机制仍需深入解析。该整合网络的失调会导致糖代谢紊乱加剧ROS积累，ROS信号通过激素途径调控基因表达，激素失衡进一步影响糖分配与抗氧化能力，形成反馈循环决定耐冷或敏感表型。当前研究多独立关注单一途径，而绒毡层-小孢子发育过程中这些途径的时空互作机制仍待阐明，未来需整合遗传学、转录组学、代谢组学及单细胞技术研究关键调控节点，为育种应用提供支撑。

1. 4.
   水稻孕穗期耐冷性的遗传解析与功能验证
   孕穗期耐冷性的遗传研究可分为QTL定位与精细作图、基因克隆与功能验证两个阶段，前者界定关联基因组区域并筛选候选基因，后者通过遗传与生理实验验证因果基因及其分子机制。
   4.1 QTL精细定位分析
   孕穗期耐冷性为高度遗传的多基因数量性状，已定位的QTLs遍布水稻12条染色体，其中qCTB8、qLTB3、qCT-3-2、qCTB10-2及qCTB7等位点经精细定位。qCTB8位于第8染色体短臂193 kb区间，候选基因LOC_Os08g44340编码单脱氢抗坏血酸还原酶，可能参与花药ROS清除，但其因果作用尚未确证。qLTB3定位于第3染色体1.2 Mb区间，解释24.4%的表型变异，候选基因LOC_Os03g59200编码醛氧化酶同源蛋白，可能参与ABA合成，LOC_Os03g57680编码DUF家族蛋白，但均缺乏功能验证。qCT-3-2在第3染色体192.9 kb区间被稳定检测到，但未鉴定到候选基因。qCTB10-2定位于第10染色体135.2 kb区间，LOC_Os10g11730、LOC_Os10g11770及LOC_Os10g11810在冷胁迫下显著诱导，可能与花粉发育相关。qCTB7是目前功能验证最充分的位点，定位于第7染色体92 kb区间，其编码的PHD指结构域蛋白在冷胁迫下特异性在幼穗上调，过表达可增强绒毡层功能、改善蔗糖代谢、提升花粉育性且不改变农艺性状，直接正调控生殖期耐冷性。
   4.2 功能基因鉴定与验证
   4.2.1 转录组辅助的候选基因筛选
   比较转录组学揭示了耐冷与冷敏感基因型在孕穗期低温响应中的系统性差异：耐冷基因型通常维持更稳定、克制的转录响应，而敏感基因型则发生广泛的转录重编程，提示转录稳态而非大规模胁迫基因诱导可能是生殖期耐冷的关键特征。差异表达主要富集于激素信号、ROS稳态、碳水化合物代谢及胁迫信号通路，耐冷基因型倾向于协同激活抗氧化系统与渗透保护代谢，而敏感基因型则表现为氧化损伤与代谢失衡相关的表达失调。可变剪接等转录后调控机制也为冷适应提供了精细调控潜力，且上述差异在花药等生殖组织中尤为显著，与花粉活力及结实率的基因型差异一致，为候选基因挖掘提供了系统框架。
   4.2.2 耐冷基因的克隆与功能鉴定
   CTB1（LOC_Os04g52830）编码F-box蛋白，是早期定位的耐冷基因，但其分子机制因亲本间表达与序列差异微小而尚未明确，可能涉及翻译后调控。APXa（LOC_Os03g17690）编码抗坏血酸过氧化物酶，过表达可增强H₂O₂清除能力，维持穗粒育性，凸显 redox 稳态的重要性。CTB4a（LOC_Os04g04330）编码富含亮氨酸重复序列受体样激酶，通过与ATP合酶β亚基互作提升幼穗ATP积累，其启动子自然变异导致粳籼间表达差异，是耐冷性的重要遗传基础。CTB2（LOC_Os04g04254）编码UDP-葡萄糖甾醇葡萄糖基转移酶，通过调控甾醇糖苷水平稳定细胞膜，保护小孢子发育。OsMAPK3（LOC_Os03g17700）是苗期与生殖期耐冷的正调控因子，通过磷酸化并稳定OsICE1，上调OsTPP1促进海藻糖积累，其自然变异与粳稻生殖期耐冷适应相关；下游靶基因OsLEA9（LOC_Os01g21250）编码晚期胚胎发生丰富蛋白，作为负调控因子，其有利单倍型通过降低表达缓解冷诱导的穗粒不育。OsbZIP73（LOC_Os09g29820）与OsbZIP71形成异二聚体，通过降低花药ABA水平、促进可溶性糖向花粉转运（部分通过qLTG3-1途径）提升结实率，其粳型等位变异是耐冷优势单倍型。OsWRKY53（LOC_Os05g27730）与OsMKKK70（LOC_Os01g50410）则作为负调控因子，通过抑制GA生物合成基因（OsGA20ox1、OsGA20ox2、OsGA3ox1）表达降低花药GA水平，其功能缺失突变体表现出更高的花药GA含量、花粉育性及结实率，揭示了GA为中心的调控轴对低温下花药发育的限制作用。ltt1突变体（LOC_Os10g34110）通过维持绒毡层适度降解、抑制花药ROS过量积累提升耐冷性，且无明显产量代价，是优异育种资源。qCTB7（LOC_Os07g07690）编码PHD指结构域蛋白，直接调控花药与花粉形态建成，过表达可维持低温下花粉细胞结构与萌发能力。新近克隆的CTB3（Os01g0923600）编码钙调素结合转录激活因子，整合Ca²⁺信号与胁迫响应基因转录调控，提升穗粒育性；CTB5（LOC_Os07g39320）编码HD-Zip转录因子，通过调控ROS清除与花药发育相关基因表达，降低ROS积累、维持绒毡层完整性并促进花粉释放。上述基因构成了涵盖MAPK与Ca²⁺信号、ABA与GA稳态、ROS清除、糖代谢、膜稳定性及绒毡层发育的多层次调控网络，为水稻孕穗期耐冷分子育种提供了关键靶标。