基因组特征、转录响应和代谢活动决定了Priestia megaterium PMA2-2与Priestia flexa PMD1-1之间矿物溶解的功能分化

《Applied and Environmental Microbiology》：Genomic traits, transcriptional responses, and metabolic activities determine functional divergence in mineral dissolution between Priestia megaterium PMA2-2 and Priestia flexa PMD1-1

　　

Priestia菌株是革兰氏阳性菌（gram-positive bacteria），广泛分布于富含矿物质的环境中。然而，Priestia菌株间矿物溶解的功能分化及其分子驱动因素仍知之甚少。研究人员采用比较表型组学和多组学分析（multi-omics analyses）来解析高效矿物溶解菌株Priestia megaterium PMA2-2与低效矿物溶解菌株Priestia flexa PMD1-1之间矿物溶解表型分化的分子机制。与PMD1-1相比，PMA2-2表现出显著增强的黑云母（biotite）溶解、培养基酸化、多糖（polysaccharide）产生以及在黑云母表面的生物膜（biofilm）形成。基因组（Genomic）分析显示，PMA2-2含有比PMD1-1更多的与有机酸代谢（organic acid metabolism）、生物膜形成和胞外多糖（EPS）生物合成相关的基因。转录组（Transcriptomic）和代谢组（metabolomic）分析将PMA2-2增强的黑云母溶解表型与其染色体和质粒上基因的协同上调以及涉及有机酸、质子外排（proton efflux）、生物膜形成、多糖产生、氨基酸代谢（amino acid metabolism）、细胞壁组分（cell wall components）和鞭毛组装（flagellar assembly）的胞外代谢物（exometabolites）产生增强联系起来。此外，参与环境感知（包括双组分系统（two-component systems）和群体感应（quorum sensing））和营养转运系统（ABC转运蛋白（ABC transporters））的基因也在PMA2-2中上调。对PMA2-2的基因组保守性（Genomic conservation）分析表明，负责高效矿物溶解的基因在Priestia属中广泛存在且系统发育保守。这些核心矿物溶解相关基因对一系列硅酸盐和氧化物矿物（黑云母、钾长石（potassium-feldspar）、橄榄石（olivine）和赤铁矿（hematite））有响应。这些发现建立了矿物溶解的基因型到表型图谱（genotype-to-phenotype map），为Priestia菌株PMA2-2和PMD1-1之间矿物溶解的功能分化以及促进这些过程的分子机制提供了新见解。重要性：迄今为止，革兰氏阳性Priestia菌株矿物溶解功能分化的分子机制在很大程度上尚未被探索。本研究描述了两种密切相关的Priestia菌株（一株高效矿物溶解菌株PMA2-2和另一株低效矿物溶解菌株PMD1-1）之间黑云母溶解功能分化的机制。与有机酸和多糖产生、质子外排、生物膜形成、细胞壁组分以及环境感知和营养转运系统相关的基因和胞外代谢物的协同上调可能是PMA2-2增强的黑云母溶解表型的原因。PMA2-2高效矿物溶解相关的多个基因在Priestia菌株中广泛存在且保守。此外，一系列硅酸盐和氧化物矿物诱导了PMA2-2中这些矿物溶解核心基因的表达。这些结果提供了关于驱动这些Priestia菌株间矿物溶解功能分化的分子机制的新理解。

细菌增强矿物溶解（mineral dissolution）是地质演化的核心驱动力，连接生物圈、岩石圈和大气圈，调节全球地球化学过程和碳循环。然而，在理解密切相关的菌株间特定的遗传和调控架构如何导致矿物风化效率的功能分化（functional divergence）方面存在显著知识空白，这限制了对关键风化剂的进化过程和生态特化的洞察。本研究旨在确定两种密切相关的Priestia菌株——高效矿物溶解菌株Priestia megaterium PMA2-2与低效矿物溶解菌株Priestia flexa PMD1-1之间矿物溶解能力的差异，并探究显著的功能分化是否由一套协调表达的核心基因模块控制，以及这些基因模块是否在Priestia菌株中保守，构成对一系列硅酸盐和氧化物矿物（如黑云母（biotite）、钾长石（potassium-feldspar）、橄榄石（olivine）和赤铁矿（hematite））环境的通用适应策略。论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。

研究人员为开展研究采用了以下几个主要关键的技术方法。样本来源：菌株PMA2-2和PMD1-1分离自中国南京紫金山麒麟掌（Dracaena cochinchinensis）根际土壤。主要方法包括：1. 比较表型分析：通过黑云母溶解实验测定Fe、Al浓度、pH、细胞数、铁载体（siderophore）、胞外多糖（EPS）和生物膜形成。2. 完整基因组测序：使用Illumina HiSeq和PacBio平台进行全基因组测序和组装。3. 转录组测序：在含黑云母的培养基中培养12小时，提取RNA进行差异表达基因（DEGs）分析。4. 代谢组学分析：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行胞外代谢物 profiling。5. RT-qPCR验证：对6个选定基因在不同矿物存在下的表达进行定量分析。6. 系统发育和序列保守性分析：对35个Priestia菌株的23个蛋白进行保守性分析。

研究结果如下：

**Divergent biotite dissolution phenotypes between PMA2-2 and PMD1-1**
通过比较表型分析，PMA2-2在6-24小时内，溶解Fe（2.9-22.3 μM）和Al（3.1-12.5 μM）浓度比PMD1-1（Fe: 0.3-2.5 μM, Al: 0.3-3.4 μM）高2.7-9.3倍（P < 0.01）。PMA2-2导致培养基pH显著降低（4.77-6.13），而PMD1-1为5.47-6.72。PMA2-2的EPS浓度（39.2-63.3 mg L^-1）比PMD1-1（7.9-34.6 mg L^-1）高68%-396%。荧光显微镜显示PMA2-2在黑云母表面形成更持久稳固的生物膜。这些结果表明，PMA2-2通过增强酸产生、EPS生产和矿物表面生物膜形成，具有更高的黑云母溶解能力。

**Genomic basis for phenotypic divergence**
基因组分析显示，PMA2-2拥有一个染色体（5,119,230 bp）和七个质粒（746,194 bp），而PMD1-1有一个染色体（3,936,812 bp）和一个质粒（35,653 bp）。PMA2-2具有5,945个基因，PMD1-1有4,016个基因，共有3,157个核心基因。PMA2-2染色体上含有更多与生物膜形成（lrgA）、EPS生物合成（pgaB, pgaD, crp）、有机酸代谢（fumC, nagK, fahA, aarC, ttuC, gudD）、细胞壁组分（vanY）和鞭毛组装（ropN）相关的基因，而这些基因在PMD1-1中缺失。关键基因如bapA（生物膜形成）、fahA（有机酸代谢）和完整的nisin样群体感应簇（nisRCFBA）仅位于PMA2-2的质粒上。这表明，PMA2-2基因组中更多与生物膜形成、细胞壁/膜生物合成、EPS生物合成、有机酸代谢、双组分系统（TCS）和群体感应（QS）相关的基因，可能是其增强矿物溶解活性的原因。

**Comparative transcriptional profiling reveals upregulated genes related to mineral dissolution by PMA2-2**
比较转录组分析（12小时，含黑云母）鉴定出PMA2-2中4,973个上调基因和116个下调基因（与PMD1-1相比）。上调的DEGs显著富集于生物膜形成、EPS生物合成、氨基酸代谢、有机酸代谢、质子外排和鞭毛组装通路。此外，双组分系统、群体感应、次级信使信号、ABC转运蛋白、分泌系统、磷酸转移酶系统和细胞壁组分相关的基因也显著上调。这些结果揭示了PMA2-2在矿物溶解过程中有更多潜在相关的上调DEGs和通路。

**Metabolomic signatures of enhanced mineral dissolution by PMA2-2**
比较代谢组学显示，PMA2-2有569个显著上调的胞外代谢物（DEEs），244个下调。上调的DEEs主要富集在有机酸及其衍生物、脂质、有机杂环化合物和有机氧化合物。KEGG通路分析表明富集于氨基酸代谢、有机酸代谢、聚糖生物合成、辅因子代谢和脂质代谢。这表明PMA2-2通过更多上调的DEEs（涉及有机酸、脂质等）参与矿物溶解。

**Multi-omics integration reveals coordinated gene-metabolite networks**
多组学整合分析中，选择了与矿物溶解相关的EPS、氨基酸、有机酸和细胞壁组分中的两类关键胞外代谢物，与相关基因进行相关性分析。结果显示，生物膜/EPS相关代谢物与19个生物合成基因显著正相关（P < 0.05）；氨基酸相关代谢物与9个氨基酸代谢基因显著正相关；有机酸相关代谢物与16个有机酸代谢基因显著正相关；细胞壁组分相关代谢物与22个细胞壁生物合成基因显著正相关。这表明PMA2-2中基因表达水平与代谢活动之间存在强正相关。

**Phylogenetic conservation of key proteins related to mineral dissolution**
对35个Priestia菌株中23个矿物溶解相关蛋白（对应最显著上调的DEGs）进行保守性分析，发现这些蛋白在10个Priestia物种中均存在同源物。在21个P. megaterium和P. aryabhattai菌株中，序列一致性为96%-100%；在其他14个菌株中为48%-94%，其中LrgB、PgaC和GlgC保守性较低。这表明Priestia属中存在一套高度保守的矿物溶解相关核心蛋白。

**Generalizability of the dissolution response to diverse minerals**
PMA2-2显著增加了钾长石中Al的释放（13.09-21.48 μM）、赤铁矿中Fe的释放（25.95-71.43 μM）以及橄榄石中Fe（15.24-30.95 μM）和Mg（1.30-1.43 μM）的释放（P < 0.001）。RT-qPCR分析显示，6个核心基因（spo0A, wecC, lysA, acs, flgF, ltaS）在PMA2-2中由黑云母、钾长石、橄榄石和赤铁矿显著诱导表达（1.4-395倍）。这表明这些基因在PMA2-2溶解多种结构不同的矿物中发挥重要作用。

讨论部分总结了PMA2-2增强的矿物溶解表型与持续的酸化和稳固的生物膜发育相关，而PMD1-1则更依赖铁载体介导的溶解。质粒上携带的关键调控和结构基因（如saeS, devR, nisRCTBA, bapA, fahA）提示质粒转移可能在增强矿物溶解能力中起关键作用。转录组和代谢组数据的整合揭示了基因表达与代谢物产生之间的强正相关网络，支持多组分协同溶解策略。核心蛋白在Priestia属中的广泛保守性以及核心基因对多种矿物的诱导响应，表明存在通用的遗传基础。研究结论部分翻译如下：总之，本研究揭示了PMA2-2拥有更多染色体和质粒上的潜在矿物溶解相关基因，并提供了对PMA2-2增强的黑云母溶解表型中多个基因和胞外代谢物协同上调的新见解。这些上调的基因和胞外代谢物涉及有机酸和EPS产生、质子外排、生物膜形成、细胞壁组分、鞭毛组装以及环境感知（包括双组分系统和群体感应）和营养转运系统（ABC转运蛋白）。负责高效矿物溶解的基因在Priestia属中广泛存在且系统发育保守。此外，一系列硅酸盐和氧化物矿物可以诱导高效矿物溶解菌株Priestia megaterium PMA2-2中这些矿物溶解核心基因的表达。这些发现不仅加深了对革兰氏阳性菌中矿物溶解功能分化及其分子驱动因素的理解，而且可能为增强此类菌株的环境应用潜力提供理论基础。