《Current Research in Parasitology & Vector-Borne Diseases》：Mixed malaria infections: A critical review and Detect-Characterise-Act surveillance framework
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混合疟疾感染（mixed malaria infections），涉及同时存在的疟原虫物种（Plasmodium species）和/或多种遗传上不同的寄生虫克隆（genetically distinct parasite clones），在常规疟疾规划中仍被
混合疟疾感染（mixed malaria infections），涉及同时存在的疟原虫物种（Plasmodium species）和/或多种遗传上不同的寄生虫克隆（genetically distinct parasite clones），在常规疟疾规划中仍被低估，尽管其对诊断、治疗、耐药性（drug-resistance）监测和消除规划（elimination planning）具有重要影响。本批判性叙述性综述综合了近期证据，优先考虑2020–2026年文献，并提出了一个将即时检测（point-of-care detection）、分子或基因组确认（molecular or genomic confirmation）以及临床或监测响应联系起来的检测-特征描述-行动框架（Detect-Characterise-Act framework）。研究人员认为，混合感染应被视为诊断灵敏度（diagnostic sensitivity）、物种特异性治疗充分性（species-specific treatment adequacy）、寄生虫种群连通性（parasite population connectivity）、诊断逃逸（diagnostic escape）和抗疟药耐药性（antimalarial resistance）的操作性信号。显微镜检查（microscopy）和许多快速诊断检测（rapid diagnostic tests）常常低估混合感染，特别是当次要物种密度低、基于HRP2的检测受pfhrp2/pfhrp3缺失影响或未检测非恶性疟原虫（non-P. falciparum）物种时。基因组方法（genomic approaches），包括靶向扩增子测序（targeted amplicon sequencing）、纳米孔测序（nanopore sequencing）和全基因组测序（whole-genome sequencing），可以解析物种身份、感染多重性（multiplicity of infection）、少数耐药性变异体（minority resistance variants）和诊断靶标完整性（diagnostic-target integrity），但需要严格的测序深度（read depth）、等位基因频率（allele frequency）、污染控制（contamination control）和样本代表性阈值。本综述贡献了四项澄清：区分混合物种感染（mixed-species infection）、物种内多重性（within-species multiplicity）和宿主内耐药性相关变异（within-host resistance-associated variation）；整合pfhrp2/pfhrp3介导的诊断逃逸；澄清非洲少数耐药性相关变异的分阶段解释；以及将混合感染重新定义为规划成熟度（programme maturity）的标志。能够检测、分型、报告和应对混合感染的国家将更有能力保护病例管理、遏制耐药性并维持疟疾消除成果。
1. 引言
混合疟疾感染（mixed malaria infections）在全球高传播和低传播背景下均具有重要意义。在撒哈拉以南非洲，恶性疟原虫（P. falciparum）占主导，但间日疟原虫（P. vivax）、三日疟原虫（P. malariae）、卵形疟原虫（P. ovale curtisi和P. ovale wallikeri）等物种在特定生态和人群中共存。在东南亚，混合物种动态可能涉及人兽共患疟原虫，特别是诺氏疟原虫（P. knowlesi）。混合感染常被低估，尤其是当次要物种密度低、诊断方法灵敏度有限时。本综述旨在将混合感染从诊断异常重新定位为诊断靶标失败、物种特异性治疗差距、寄生虫种群连通性和基因组耐药性信号的汇聚点。核心问题是：如何检测、分子或基因组特征化、解释混合疟疾感染，并将其转化为相称的临床或公共卫生行动？综述提出了检测-特征描述-行动框架（Detect-Characterise-Act framework），并区分了混合物种感染、物种内感染多重性（multiplicity of infection）和宿主内耐药性相关变异（within-host resistance-associated variation）三个层次。
2. 证据综合方法与方法学严谨性
本研究采用批判性叙述性综述方法，而非正式系统性综述。目的是整合来自疟疾流行病学、诊断学、基因组学、耐药性监测、临床管理和规划实施的异质性证据，形成决策导向框架。证据搜索涵盖2020年1月1日至2026年7月14日发表的文献，并保留了必要的早期基础研究。搜索数据库包括PubMed/MEDLINE、Scopus、Web of Science等。使用布尔逻辑组合核心搜索词，如“混合疟疾感染（mixed malaria infection）”、“感染多重性（multiplicity of infection）”、“pfhrp2/pfhrp3缺失”、“K13青蒿素耐药性”等。纳入标准包括报告混合物种感染、评估感染多重性、评价诊断性能、报告耐药性或诊断靶标缺失标记等。排除标准包括非人类疟疾研究、缺乏方法学信息的文献等。证据评估采用五条标准：与混合物种感染的相关性、方法学透明度、诊断标准和检测限、物种覆盖范围以及直接政策相关性。最终引用36篇文献，包括29篇同行评审出版物和7篇WHO来源。
3. 概念定义与分析层次
“混合疟疾感染”一词常被用于描述生物学和分析上不同的现象。本综述识别三个不同层次：混合物种感染（mixed-species infection）、物种内感染多重性或复杂性（multiplicity or complexity of infection）以及宿主内耐药性相关变异（within-host resistance-associated variation）。混合物种感染指同一宿主中同时存在两种或以上人类感染疟原虫物种，检测强烈依赖于诊断方法，分子方法通常更灵敏。感染多重性指单一物种内遗传上可区分的寄生虫谱系数量，其估计值取决于标记多样性、测序深度和等位基因频率阈值等。多克隆感染（polyclonal infection）是描述性生物学条件，不应被视为精确数值。宿主内耐药性相关变异指同一样本中检测到野生型和耐药性相关等位基因以不同频率共存，其解释需要分阶段验证，包括技术确认、标记验证和临床证据。表1总结了这些分析区分。
4. 本研究的创新性与原创贡献
本综述的主要创新是将流行病学、诊断学、基因组学、治疗和消除响应整合为单一决策路径。贡献包括四项原创性澄清：第一，区分混合物种感染、感染多重性和耐药性相关变异，阐明单一术语无法支持所有临床和监测决策。第二，将诊断逃逸（diagnostic escape）整合到混合感染解释中，特别是在使用HRP2（组氨酸丰富蛋白2）快速诊断检测（RDT）的地区，需要排除pfhrp2/pfhrp3缺失。第三，提出耐药性意识解释，强调在非洲多克隆感染中，耐药性相关变异可能以少数频率出现，需要报告等位基因频率阈值和测序深度标准。第四，提出操作成熟度视角，认为能够检测、特征化和应对混合感染的国家通常具有更强的实验室网络和治疗效果监测能力。
5. 混合疟疾感染的当代流行病学
混合疟疾感染的全球分布反映了寄生虫物种重叠、病媒生态、人类流动性、免疫状态、诊断强度和治疗历史。在撒哈拉以南非洲，恶性疟原虫占主导，但三日疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫在特定生态中出现。在美洲，间日疟原虫的复发生物学要求根治治疗。在东南亚，混合感染对消除至关重要。混合物种感染常被低估，显微镜检查和常规报告系统可能漏检低密度次要物种。系统综述和荟萃分析表明混合感染可能与重症疟疾相关，但方向取决于寄生虫密度、宿主免疫和物种组合。宿主内相互作用复杂，可能涉及竞争或促进，需要分子定量而非简单分类检测。感染多重性提供了第二层流行病学信息，在高传播地区常为多克隆，在消除地区可能指示输入或持续传播。人类流动性、气候变化、土地利用变化和病媒适应进一步复杂化流行病学。
6. 基因组特征化：从检测到传播情报
基因组特征化将混合感染分析从检测扩展到种群结构、连通性、耐药性、诊断逃逸和复发的推断。全基因组测序（WGS）提供最广泛的寄生虫变异视图，但技术要求高，需要控制低寄生虫密度、高人类DNA背景和等位基因频率混合物。6.1节将分子和基因组方法与分析问题匹配：物种确认需要验证的物种特异性靶标和对照；寄生虫定量需要定量方法和参考标准；感染多重性估计需要多态性标记和明确的分析模型；少数变异体检测需要预设报告阈值、足够测序深度和错误特征；复发分类需要配对样本和分型标记；种群连通性推断需要代表性采样和流行病学元数据。靶向扩增子测序和杂交捕获面板提供更可扩展的替代方案，例如从干血斑（dried blood spots）进行靶向纳米孔测序。基因组监测框架应包括物种确认、寄生虫密度或测序深度代理、感染多重性估计、耐药性标记（包括pfk13、pfcrt、pfmdr1、plasmepsin 2/3拷贝数、pfdhfr/pfdhps等）以及诊断靶标位点（pfhrp2和pfhrp3）。技术可行性不保证常规规划可用性，需要简化工作流程、质量保证和人员培训。6.2节解释少数耐药性相关变异：低频率序列调用不应自动视为临床有意义耐药性证据，需要分阶段评估，包括技术确认、标记验证、克隆扩增证据和临床疗效数据。表2提供了证据层级，区分不确定序列调用、已确认少数变异体、候选耐药性标记、验证耐药性标记、克隆扩增和临床显著耐药性。
7. 诊断学：批判性评估与操作意义
诊断选择应与决策匹配。即时病例管理仍依赖WHO推荐的显微镜检查和RDT，但需承认其局限性。HRP2-RDT尤其易受pfhrp2/pfhrp3缺失影响，WHO将其视为生物威胁。HRP2-RDT阴性结果不应直接等同于基因缺失，需排除低密度、操作错误、储存问题等。缺失调查需确认寄生虫DNA充足、使用对照位点，并区分三个证据水平：疑似诊断逃逸、实验室确认缺失和人群水平政策相关证据。分子检测提供更高灵敏度，但并非单一解决方案，需分层使用：现场使用RDT或显微镜；地区级对复发、严重病例、不一致结果进行分子确认；国家级对子集样本进行测序。诊断报告应明确物种、方法、密度和临床意义。实施需明确样本和信息路径，包括人员培训、数据标准化和转诊系统。
8. 治疗影响与药物耐药性
混合疟疾感染的治疗必须覆盖所有临床相关物种和生命阶段。对于无并发症恶性疟，推荐基于青蒿素的联合疗法（ACT），但需监测青蒿素部分耐药性和伴侣药物耐药性。对于间日疟或卵形疟，根治治疗需使用8-氨基喹啉类药物（如伯氨喹或他非诺喹），并评估葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症。混合感染可复杂化治疗效果解释，多克隆感染中敏感克隆被清除后耐药克隆可能复发。在非洲，多克隆感染与耐药性监测相关，可掩盖早期检测，增加重组机会，并复杂化遏制。药物选择需根据物种组成、严重程度、患者因素、国家政策和当地耐药性模式。消除导向治疗需区分清除无性期、预防复发（根治）和减少传播三个目标。对于混合恶性疟加间日疟或卵形疟，需考虑血液期治疗、物种特异性根治治疗和传播减少治疗（如单低剂量伯氨喹）。
9. 公共卫生与消除意义
混合感染影响个体患者外，还可维持传播、偏倚监测指标。依赖HRP2-RDT的规划可能低估恶性疟在pfhrp2/pfhrp3缺失地区的负担，并高估非恶性疟物种比例。疫苗实施可能改变流行病学模式，但证据有限。消除规划中，混合感染应链接到响应系统，如家庭筛查、旅行史调查和病媒评估。能力建设至关重要，分子和基因组监测应嵌入流行国家机构。成本效益应评估监测策略而非测序平台本身。规划应采用分阶段实施模型，先进行明确哨点应用，评估后逐步扩大。采样框架需根据监测目标确定，如设施采样适合临床监测，社区调查适合消除规划。
10. 拟议的整合框架
本综述提出检测-特征描述-行动框架（Detect-Characterise-Act framework），将常见诊断或监测触发因素与所需的特征化水平、个体层面行动和规划层面干预条件联系起来。检测阶段使用前线诊断并标记需要确认的病例；特征化阶段应用分子或测序工具解析物种、量化密度、估计感染多重性、识别耐药性标记和诊断靶标完整性；行动阶段将发现转化为临床治疗、RDT政策、治疗效果监测、焦点响应或跨境监测。框架区分分析发现、验证生物学发现和足以支持规划行动的证据。例如，低频率耐药性相关序列调用需先技术验证，HRP2-RDT阴性结果需先确认寄生虫感染而非直接视为缺失。表3总结了框架的操作细节。图1展示了五个常见场景的路径：混合物种感染、物种内多重性、耐药性相关变异、疑似诊断靶标失败以及输入或跨境感染。从基因组证据到国家政策需考虑代表性、精确性、临床后果、可行性、公平性、预算影响等。
11. 研究空白与优先事项
主要空白包括：流行率估计难以比较，因定义、检测和采样人群不同；缺乏整合临床结局、寄生虫密度、配子体携带、耐药性标记和治疗随访的队列研究；非恶性疟原虫物种在基因组监测中代表性不足；多数研究为横断面设计。高影响力研究议程应包括前瞻性多国队列，使用标准化分子面板，量化寄生虫密度和配子体，测序耐药性和诊断靶标位点，并随访治疗。加强报告标准，明确混合感染指物种、克隆还是耐药性基因型。经济评估应比较不同哨点设计的政策价值。从常规病例计数转向分子或基因组监测需要机构变革，而非单纯实验室采购。
12. 研究局限性
本批判性叙述性综述存在选择偏倚，因纳入基于相关性判断而非完全系统筛选。发表偏倚可能偏向报告异常混合感染或成功分子检测的研究。语言限制（仅英语）可能导致遗漏法语、葡语等流行地区证据。基因组证据在物种间分布不均，恶性疟原虫基础设施最强，间日疟次之，三日疟和卵形疟仍被忽视。诊断验证存在差异，分子检测的检测限不同。因此，本综述避免声称任何单一技术普遍优越，而是主张分层诊断和基因组策略。
13. 结论
混合疟疾感染不应被视为单一生物学或诊断类别。混合物种感染、物种内感染多重性和宿主内耐药性相关变异涉及不同分析单元、错误来源和临床监测意义。其解释需要问题特异性方法和相称证据。理解混合感染需整合流行病学、分子诊断、基因组学、治疗政策和监测响应。最强的未来研究不仅报告混合感染存在，还将识别哪些混合感染重要，在何种生态和临床条件下，以及规划在检测到时应采取哪些不同行动。提出的检测-特征描述-行动框架提供了从改进检测到政策相关行动的实用路径。能够检测、特征化、报告和应对混合感染的国家将更有能力保护病例管理、遏制耐药性并维持疟疾消除进展。
