功能筛选获得鹅粪便微生物组中不动杆菌属磷酸乙醇胺转移酶基因赋予大肠杆菌多黏菌素抗性

《Applied and Environmental Microbiology》：A functionally selected Acinetobacter sp. phosphoethanolamine transferase gene from the goose fecal microbiome confers colistin resistance in E. coli

　　

摘要翻译：多黏菌素是治疗由多重耐药革兰氏阴性菌（如肠杆菌科、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌）引起的感染的最后手段抗生素。这使得表现出多黏菌素E（colistin）抗性（主要通过脂质A修饰）的细菌的增多令人担忧，并表明记录相应抗性基因的潜在来源非常重要。本研究通过调查先前对鹅粪便微生物组进行的多黏菌素抗性功能宏基因组筛选，寻找环境中潜在的新兴多黏菌素抗性基因。研究人员发现该筛选捕获了不动杆菌属（Acinetobacter sp.）DNA片段，这些片段均含有eptA基因。研究人员确认了这些基因通过修饰外膜脂质A赋予大肠杆菌显著多黏菌素抗性的能力。此外，研究人员发现了不动杆菌基因组中紧密相关的eptA基因被 mobilizable 的证据，标志着它们可能是潜在的mcr基因或其前体。本研究强调了功能宏基因组筛选多黏菌素抗性在捕获来自意外环境来源（如鹅粪便微生物组）基因方面的潜力。

论文解读文章

一、研究背景与问题

多黏菌素类抗生素（包括多黏菌素B和多黏菌素E，即colistin）是治疗多重耐药革兰氏阴性菌感染的最后防线药物。然而，随着细菌通过修饰脂质A（lipid A）而获得多黏菌素抗性的机制日益普遍，尤其是可移动的磷酸乙醇胺转移酶基因（如mcr-1）的发现，严重威胁了这类药物的临床有效性。mcr-1最初于2015年在中国的一头猪源大肠杆菌分离株中被发现，其定位于质粒上，可通过水平基因转移传播，这引起了人们对动物作为多黏菌素抗性传播媒介的担忧。尽管已知mcr基因家族编码的酶与eptA基因家族编码的酶在功能上相似（均为磷酸乙醇胺转移酶），但mcr基因的可移动性使其具有更大的公共卫生风险。目前，环境微生物组中可能还存在未被发现的mcr同源基因或前体，尤其是那些来自非模式生物或非临床生物（如野生鸟类肠道微生物）的基因。因此，系统性地从环境中筛选和鉴定潜在的新兴多黏菌素抗性基因，对于理解抗性基因的传播和进化具有重要意义。

二、研究内容与结论

本研究基于先前构建的鹅粪便微生物组功能宏基因组文库（约27 Gb，含约1.2×10⁸个克隆），在多黏菌素4 μg/mL和8 μg/mL浓度下进行功能筛选。研究人员从4 μg/mL筛选平板获得约360个抗性菌落，并对其中16个最大克隆簇（CST1-CST16）及8 μg/mL筛选获得的额外片段（CST17）进行深入分析。通过长读长测序和基因注释，发现所有15个成功克隆的插入片段均来源于一种不动杆菌（Acinetobacter sp.），且均含有eptA同源基因（编码磷酸乙醇胺转移酶）。这些片段还包含预测的双组分调控系统基因（组氨酸激酶和响应调节子）以及部分醇脱氢酶基因。

通过将eptA基因（特别是CST17中的EptA17）在大肠杆菌DH10B中异源表达，研究人员进行了琼脂稀释法、微量肉汤稀释法和MIC试纸条法测定。结果显示，除个别克隆（CST4、CST9）外，所有克隆均降低了大肠杆菌对多黏菌素的敏感性，其中CST3、CST10、CST14和CST17在≥2 μg/mL多黏菌素浓度下仍能生长，CST17在4 μg/mL下生长良好。CST10和CST17的半数抑制浓度（IC₅₀）约为2.5 μg/mL和4 μg/mL，与阳性对照（表达mcr-1）相当，显著高于阴性对照（约1 μg/mL）。MIC试纸条实验证实，CST10和CST17的MIC值分别为3 μg/mL和4 μg/mL，达到临床耐药折点（>2 μg/mL）。

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分析脂质A，研究人员发现CST10和CST17表达的eptA基因导致脂质A质量增加约123 m/z（从1797.2 m/z增至1920.3 m/z），与添加一个磷酸乙醇胺基团一致，证实了其修饰脂质A的机制。

进一步生物信息学分析表明，这些eptA基因在不动杆菌属内具有可移动性证据。复合序列的5'端（含eptA基因）与Acinetobacter sp. ASP199染色体（约95%同一性）及A. radioresistens DD78质粒pAR3（约94%同一性）高度匹配，而3'端（含醇脱氢酶基因片段）则与Acinetobacter sp. XS-4基因组匹配。此外，该复合序列还与鲍曼不动杆菌VB473基因组的四个区域呈现高同一性，这些区域包含整合酶、转座酶、毒素-抗毒素系统、PAP2磷酸酶基因（已知与高水平多黏菌素抗性相关）以及预测的抗生素抗性基因（如mupB、iri、rox等）。这些发现表明，该eptA基因可能位于可移动遗传元件上，具有成为mcr基因或其前体的潜力。

三、关键技术与方法

本研究采用的主要关键技术包括：功能宏基因组学筛选（functional metagenomics），即从鹅粪便样本（采自美国西北大学埃文斯顿校区湖滨草坪，2020年8月，坐标42°03′21.9″N, 87°40′14.4″W）提取宏基因组DNA，构建克隆文库并涂布于含多黏菌素的平板上筛选抗性克隆；长读长测序（PacBio Sequel II）对插入片段进行测序；基因注释和系统发育分析（Bakta、MetaGeneMark、blastp、Clustal Omega、IQ-Tree）；脂质A提取和MALDI-TOF质谱分析；抗菌药物敏感性测试（琼脂稀释法、微量肉汤稀释法、MIC试纸条法）。

四、研究结果

（1）多黏菌素抗性DNA片段的特征：从功能宏基因组筛选中获得的15个克隆插入片段均来自不动杆菌属，含有eptA基因，且核苷酸同一性高（平均97.62%），表明它们来源于同一基因组区域。

（2）eptA表达赋予大肠杆菌临床水平多黏菌素抗性：CST10和CST17克隆的IC₅₀值和MIC值均达到临床耐药水平，与mcr-1阳性对照相当。

（3）脂质A重塑：质谱分析证实eptA表达导致脂质A添加磷酸乙醇胺基团，质量增加123 m/z。

（4）eptA17在不动杆菌内的可移动性：通过比对发现eptA基因存在于多种不动杆菌基因组和质粒中，且与转座酶、整合酶、毒素-抗毒素系统等移动元件相关，暗示其可能被动员。

五、讨论与结论

本研究表明，功能宏基因组筛选能够从环境微生物组（如鹅粪便）中捕获赋予临床水平多黏菌素抗性的eptA基因。这些基因虽然被注释为eptA同源物，但因其具有可移动性特征（存在于质粒、邻近移动元件）且能赋予超过EUCAST耐药折点的抗性水平，可能应被视为潜在的mcr基因或前体。研究局限性包括：无法确定原始宿主的确切菌种，以及异源表达可能无法完全反映天然环境中的抗性水平。然而，该发现强调了野生鸟类（如鹅）作为抗性基因传播媒介的潜在作用，并提示在监控多黏菌素抗性时需关注非临床环境中的抗性基因储库。总之，这项工作扩展了对环境磷乙醇胺转移酶基因多样性和可移动性的认识，为预防新兴多黏菌素抗性传播提供了重要参考。