多杀性巴氏杆菌B型荚膜生物合成蛋白的表征

《Infection and Immunity》：Characterization of Pasteurella multocida type B capsule biosynthesis proteins

　　

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）可引起多种严重动物疾病，包括偶蹄动物的出血性败血症。该菌分为5种荚膜基因型与9种脂多糖（LPS）基因型，迄今仅B型与E型荚膜菌株自出血性败血症病例中分离得到。B型荚膜主链已被确定为N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）与N-乙酰甘露糖醛酸（ManNAcA）重复单元，并带有果糖与甘氨酸侧链。研究人员以产B型荚膜的野牛出血性败血症分离株M1404为对象，利用荚膜吸光度测定、阿尔新蓝染色、荚膜Western印迹评估荚膜生产与导出，并结合源内碰撞诱导解离质谱（IS-CID MS）解析荚膜结构，表明BcbC可能为荚膜合酶；BcbE与BcbG参与果糖侧链添加，BcbH可能为甘氨酸转移酶。失活bcbE、bcbG或bcbH显著降低了M1404总体荚膜产量。此外，在A型荚膜突变株VP161中异源表达bcbABCDI，可生产出与B型主链无差异的GlcNAc-ManNAcA重复单体，证明这些基因对B型主链多糖合成必要且充分。

研究背景与立项依据

多杀性巴氏杆菌是多种哺乳动物与禽类上呼吸道正常菌群成员，亦可致禽霍乱、猪萎缩性鼻炎、牛呼吸道疾病及偶蹄动物出血性败血症（HS）等。HS呈系统性且常快速致死，在亚洲与非洲造成显著经济负担，所有HS分离株均为B型或E型荚膜伴L2型LPS。荚膜为该菌关键毒力因子，无荚膜株丧失致病力。该菌借助ABC转运依赖机制合成荚膜：于内膜Kdo连接子（连接磷脂酰甘油）上聚合，再经同源ABC系统导出。B型与E型荚膜主链同为GlcNAc-ManNAcA，但糖苷键与侧链不同——B型主链为[-4)GlcNAc(β1-3)ManNAcA(β1-]n，ManNAcA的C3连果糖、C6连甘氨酸；E型主链连键位移且果糖连C4、无甘氨酸。荚膜基因座分三区：1区（ABC转运，保守）、2区（糖单体生产与型特异性合成，型间差异）、3区（Kdo连接子合成，保守）。B/E型2区含9基因，其中4个型特异。前期生信预测BcbA/BcbB同源大肠杆菌WecB/WecC（参与UDP-ManNAcA合成），BcbC含糖基转移酶域，BcbE/F/G涉果糖添加，BcbH涉甘氨酸添加；但bcbH突变体小鼠毒力下降且抗B型血清免疫荧光弱，提示需实验确证。鉴于荚膜决定宿主嗜性与致病，厘清B型合成逻辑对新型防治具基础意义。本文发表于《Infection and Immunity》。

主要关键技术方法

研究人员采用ClosTron（移动II型内含子）系统于M1404构建bcbC、bcbE、bcbG、bcbH单基因插入失活突变体及反式互补株；以VP161 hyaD突变体为异源背景，电转化含bcbABCDI的穿梭质粒pAL99S实现主链异源合成。表型与结构联用：荚膜吸光度法（640 nm Stains-All）、阿尔新蓝染色（125 μg/mL）与抗B型兔多抗Western印迹评表面/胞内荚膜；ESI-MS源内碰撞诱导解离（IS-CID，锥电压160 V）解析多糖碎片离子；生信端用CCD数据库、AlphaFold3结构预测及Foldseek比对PDB100（TarS 5TZ8、PimB′ 3OKA）佐证BcbC双GT域。样本源于北美野牛HS株M1404与越南鸡禽霍乱A型株VP161及其突变体。

研究结果

BcbC is essential for capsule production

BcbC经CCD注释含GT-A/GT2（342–448 aa）与WbuB样（681–1000 aa）双域；AlphaFold3结构两段分别比对金黄色葡萄球菌TarS（5TZ8，0.99 ?/127对）与谷氨酸棒杆菌PimB′（3OKA，1.32 ?/73对），二者皆已证为糖基转移酶。bcbC::intron突变体荚膜吸光度近本底，阿尔新蓝无高分子量带，抗B型Western全胞裂解液无信号，IS-CID未检出m/z 275.5（HexNAcA+Gly）与478.3（HexNAcA+Gly+HexNAc）等B型特征离子；反式补bcbC恢复至超野生型。结论：BcbC为B型荚膜合酶。

Inactivation of bcbE, bcbG, or bcbH results in modified capsule structure and nearly complete loss of capsule production in P. multocida strain M1404

bcbE/bcbG突变体IS-CID仅见421.2（HexNAcA+HexNAc）、624.3（HexNAcA+2HexNAc）、646.3（2HexNAcA+HexNAc），缺果糖与甘氨酸；bcbH突变体缺275.2与478.3、保留605.1（HexNAcA+HexNAc+Hex+Na），示失甘氨酸而留果糖。三者表面/胞内荚膜量均近消失（吸光度、阿尔新蓝、Western一致），互补bcbE恢复结构至野生型，bcbG/bcbH互补恢复结构离子但未恢复表面量。结论：BcbE与BcbG为果糖侧链添加必需，BcbH为甘氨酸转移酶；合成次序为主链→果糖→甘氨酸；侧链缺失致总体合成效率崩溃。

A P. multocida strain VP161 hyaD mutant expressing bcbABCDI produces type B-like main chain capsule

VP161 hyaD突变体（透明质酸酶敏感A型荚膜缺失）携pAL99S空载体无荚膜；转bcbABCDI后吸光度回升，透明质酸酶处理不改变信号，阿尔新蓝见表面高分子量带，抗B型Western阳性，IS-CID见421.2、624.6、842.1（2HexNAcA+2HexNAc）即GlcNAc-ManNAcA主链，与M1404 bcbE/bcbG突变体一致且异于透明质酸（m/z 203.9等）。结论：bcbABCDI在A型背景下必要且充分合成B型主链，A/B型ABC转运（HexABCD/CexABCD）与Kdo连接子（PhyAB/LipAB）功能可互换。

讨论与结论翻译

讨论指出，IS-CID联合既往NMR结构判定各株荚膜；bcbC双GT域同源已知合酶且失活终止合成，支持其为合酶（不排除兼影响ManNAcA，但BcbA/BcbB已覆盖WecB/WecC同源路径）。bcbE/G/H突变改构且近终止总产量，暗示内膜复合体化学计量扰动。异源主链产量同野生型A型，侧链非主链转运所需；全region 2克隆转VP161无转化子，提示表达负荷或调控冲突。原生背景侧链基因失活近消除表面荚膜，而TraDIS示体内存活需全荚膜座，故完整B型座为表面荚膜必需。本研究为首例多杀性巴氏杆菌荚膜型间遗传互换，铺路同基因背景不同荚膜型的毒力对照研究。

结论：BcbC为B型荚膜合酶；BcbE与BcbG负责ManNAcA C3果糖添加，BcbH负责C6甘氨酸添加，次序为主链聚合→果糖→甘氨酸；bcbE/G/H任一失活均使M1404总体荚膜近消失；bcbABCDI异源表达于VP161 hyaD突变体可重建造B型主链（GlcNAc-ManNAcA）且无侧链、抗透明质酸酶，证明其对主链合成必要且充分。