镉暴露与NIT-1细胞及小鼠胰腺组织中铁死亡相关氧化还原/铁失衡及特定m5C调控蛋白丰度改变相关：一项初步描述性研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Cadmium exposure is associated with ferroptosis-related redox/iron imbalance and altered abundance of selected m5C regulatory proteins in NIT-1 cells and mouse pancreatic tissue: A preliminary descriptive study

　　

镉（Cd）是一种环境毒物，与胰腺功能障碍和葡萄糖代谢紊乱相关。尽管铁死亡已被认为参与镉毒性，但镉暴露是否伴随胰腺β细胞相关系统中特定RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）调控蛋白的改变仍不清楚。本研究将小鼠NIT-1细胞暴露于CdSO₄（4 μmol/L），并通过ferrostatin-1（Fer-1）和erastin联合细胞活力、乳酸脱氢酶（LDH）释放、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）、细胞内Fe²⁺及铁死亡相关蛋白的检测评估铁死亡相关损伤。同时，在慢性CdSO₄暴露后分析小鼠胰腺组织。CdSO₄降低NIT-1细胞活力并增加LDH活性、ROS、MDA和Fe²⁺水平。Fer-1部分改善细胞活力并减轻ROS和MDA，而erastin加剧镉相关损伤。镉暴露增加NIT-1细胞中铁蛋白轻链（FTL）丰度并降低SLC7A11和GPX4；小鼠慢性CdSO₄暴露伴随铁死亡相关蛋白改变、胰腺Fe²⁺升高及血清胰岛素降低。此外，镉暴露与特定m5C调控蛋白丰度改变相关，包括NIT-1细胞中NSUN2降低和TET2升高，以及小鼠胰腺组织中NSUN2、NSUN6、ALYREF和TET2的改变。总体而言，本初步描述性研究表明CdSO₄暴露与NIT-1细胞和小鼠胰腺组织中铁死亡相关氧化还原/铁失衡相关，并伴随特定m5C调控蛋白丰度改变。然而，由于未评估血清和胰腺镉负荷、正式重复水平相关性分析、全局或转录本特异性m5C标记及因果调控实验，这些发现应被解释为关联性和描述性证据，而非内部镉负荷-反应关系或m5C介导的铁死亡调控直接机制的证据。

**研究背景与科学问题**

镉是一种具有生物蓄积性和多器官毒性的环境污染物与内分泌干扰毒物。流行病学与实验研究证据已表明，镉暴露与糖代谢受损、2型糖尿病（T2DM）风险升高及胰腺功能障碍密切相关。既往研究提示，长期或低剂量镉暴露可影响空腹血糖、改变胰岛素水平并增加糖尿病风险。动物实验进一步表明，镉可能通过干扰脂质代谢和氧化还原稳态影响胰腺β细胞功能与存活。近年研究关注到胰腺β细胞对镉暴露的易感性，镉可能通过破坏细胞内铁代谢和氧化还原平衡，激活铁依赖性脂质过氧化通路，诱导铁死亡。铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的细胞死亡形式，其分子基础包括细胞内游离Fe²⁺升高、活性氧（ROS）增加及SLC7A11/GSH/GPX4抗氧化轴的失活。近期研究已证实铁死亡参与多种重金属暴露引起的组织器官损伤，包括镉暴露小鼠胰岛和β细胞系中GPX4水平降低、脂质过氧化增加，且可被ferrostatin-1（Fer-1）部分拮抗。然而，镉暴露是否伴随RNA 5-甲基胞嘧啶（m5C）调控蛋白丰度的改变尚不清楚。m5C是近年来受到关注的表观转录组标记，参与RNA代谢过程，包括mRNA稳定性、出核和翻译。m5C通路涉及NSUN家族甲基转移酶、TET家族氧化/去甲基化相关因子以及ALYREF和YBX1等阅读蛋白。既往研究虽已将镉暴露与胰腺β细胞功能障碍、氧化损伤和铁死亡相关通路联系起来，但大多数证据集中于经典细胞毒性或铁死亡标志物。镉相关氧化还原/铁失衡是否伴随RNA m5C调控蛋白丰度改变仍缺乏了解。本研究针对这一空白，在NIT-1细胞和小鼠胰腺组织中同时检测铁死亡相关损伤标志物和特定m5C调控蛋白，旨在描述镉暴露与这些分子改变的关联特征。

**研究设计与技术方法**

研究人员采用小鼠胰岛素瘤β细胞系NIT-1细胞（来源：广州Gineo Biotechnology Co., Ltd.）作为体外模型，使用4 μmol/L CdSO₄处理24小时，并联合铁死亡抑制剂Fer-1（2 μmol/L）和铁死亡诱导剂erastin（2.5 μmol/L）进行药理学干预。主要技术方法包括：CCK-8法检测细胞活力；DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平；硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量；LDH活性测定评估细胞膜完整性；FerroOrange荧光探针检测细胞内Fe²⁺；Western blot检测铁死亡相关蛋白（FTL、SLC7A11、GPX4、ACSL4）和m5C调控蛋白（NSUN2、NSUN6、TET2、ALYREF、YBX1）的丰度。在体内实验中，8周龄雄性C57BL/6J小鼠（河南Skibbes Bio-technology Co., Ltd.）随机分为四组（每组7只），分别通过饮水给予0、50、100和200 mg/L CdSO₄持续18周。检测指标包括空腹血糖（每4周测定）、血清胰岛素、胰腺组织铁死亡相关蛋白和m5C调控蛋白丰度、组织Fe²⁺含量、H&E染色评估胰岛形态，以及探索性多重免疫荧光检测胰岛内SLC7A11和NSUN2表达。

**研究结果**

**3.1 Fer-1和erastin浓度的筛选及对镉相关细胞损伤的调控**

Fer-1在16 μmol/L及以上浓度时呈剂量依赖性降低NIT-1细胞活力。选择对基础细胞活力无显著影响的1、2和4 μmol/L Fer-1与4 μmol/L CdSO₄联合处理。与CdSO₄单独处理组（细胞活力59.25%）相比，2 μmol/L Fer-1+CdSO₄组细胞活力升至72.31%（P<0.05），而1和4 μmol/L Fer-1无显著差异。erastin在2.5至40 μmol/L范围内呈剂量依赖性降低细胞活力。2.5 μmol/L erastin对细胞活力影响较小（91.87%），但与4 μmol/L CdSO₄联合后细胞活力降至27.39%，显著低于CdSO₄单独处理组（61.50%，P<0.05）。据此确定2 μmol/L Fer-1和2.5 μmol/L erastin作为后续实验浓度。

**3.2 CdSO₄暴露增加LDH释放、氧化应激和Fe²⁺蓄积，Fer-1和erastin部分调节这些变化**

CdSO₄处理显著增加LDH活性（1.91倍）、MDA含量（2.11倍）、ROS荧光强度（2.49倍）和细胞内Fe²⁺水平（1.50倍）。Fer-1+CdSO₄组较CdSO₄组LDH降低（0.79倍）、MDA降低（0.86倍）、ROS降低（0.75倍），但Fe²⁺无显著变化。erastin+CdSO₄组较CdSO₄组LDH升高（1.23倍）、MDA升高（1.34倍），ROS和Fe²⁺无显著差异。以对照组和CdSO₄组为参照，Fer-1挽救约32.1%的活力损失，减少约47.3%的LDH升高、28.3%的MDA升高和44.1%的ROS升高，但未显著降低细胞内Fe²⁺蓄积，表明Fer-1提供部分保护而非完全逆转。

**3.3 CdSO₄暴露改变NIT-1细胞铁死亡相关蛋白和特定m5C调控蛋白丰度**

CdSO₄暴露增加FTL丰度，降低SLC7A11和GPX4丰度，ACSL4在现有条件下亦降低。与相应Fer-1或erastin单独处理组相比，联合处理组FTL升高、SLC7A11和GPX4降低。m5C调控蛋白方面，NSUN2在CdSO₄、Fer-1+CdSO₄和erastin+CdSO₄组均降低，TET2在CdSO₄和erastin+CdSO₄组升高，而NSUN6、ALYREF和YBX1在大多数条件下无显著变化。

**3.4 CdSO₄暴露对小鼠空腹血糖、血清胰岛素和胰岛形态的影响**

18周CdSO₄饮水暴露后，仅200 mg/L组空腹血糖较对照组有统计学显著变化，但各暴露组间未呈现一致的高血糖模式。血清胰岛素随CdSO₄浓度升高而降低（P<0.05）。对照组与200 mg/L组的胰岛素免疫荧光强度和H&E染色显示的胰岛数目及胰岛面积均无显著差异，提示血清胰岛素降低发生在无明显H&E可检测的胰岛结构改变之前。

**3.5 慢性CdSO₄暴露后小鼠胰腺组织铁死亡相关改变和特定m5C调控蛋白丰度改变**

慢性CdSO₄暴露小鼠胰腺组织中，FTL在所有暴露组均高于对照，SLC7A11和ACSL4仅在200 mg/L组显著降低，GPX4仅在100 mg/L组显著降低（非单调响应）。胰腺Fe²⁺含量随CdSO₄剂量增加并在200 mg/L组达到统计学显著。m5C调控蛋白方面，NSUN2在所有暴露组均升高，NSUN6在100和200 mg/L组升高，ALYREF在200 mg/L组升高，TET2仅在50 mg/L组显著升高，YBX1无变化。体外与体内结果在个别m5C调控蛋白改变方向上不完全一致，研究人员将其解释为模型依赖性响应。

**3.6 小鼠胰岛中SLC7A11和NSUN2的探索性免疫荧光**

在对照组和200 mg/L CdSO₄组胰腺切片中进行SLC7A11和NSUN2的多重免疫荧光检测。定量分析显示CdSO₄暴露小鼠胰岛中SLC7A11荧光强度降低而NSUN2荧光强度升高（P<0.05）。该分析为半定量信号变化，不用于推断分子间直接相互作用或机制性关联。

**讨论与结论**

Fer-1的部分保护作用提示脂质过氧化敏感性铁死亡样损伤参与了CdSO₄相关细胞毒性，但不能完全解释整体损伤反应。镉暴露可能还涉及线粒体功能障碍、凋亡、坏死性损伤、内质网应激、炎症应激或自噬相关通路，这些通路未在本研究中直接检测。ACSL4下调和GPX4非单调响应提示现有条件下铁死亡相关蛋白改变不应被描述为完全经典的铁死亡标志物谱，而应视为铁死亡相关氧化还原/铁失衡。血清胰岛素降低而胰岛形态学保存的差异可能反映早期功能性损伤先于明显结构性损伤。体外与体内模型中m5C调控蛋白改变方向的不一致提示m5C相关响应具有背景依赖性，两种模型在通路水平上相互支持——均显示CdSO₄相关氧化还原/铁紊乱、铁死亡相关蛋白改变和特定m5C调控蛋白丰度改变，但应视为并发改变而非因果证据。本研究主要贡献在于在体外β细胞相关模型和体内胰腺组织模型中平行表征了镉暴露下的铁死亡相关损伤特征和特定m5C调控蛋白变化。研究局限性包括：未直接量化血清、全胰腺和胰岛镉负荷；未进行正式重复水平相关性分析；蛋白质分析使用全胰腺组织而非分离胰岛或纯化β细胞；小鼠暴露浓度相对较高限制外推；未测量全局或转录本特异性m5C标记；未进行m5C调控因子的功能获得或缺失实验；Fer-1仅部分减轻镉相关损伤，其他死亡或应激通路未检测；免疫荧光分析为半定量。结论：本初步描述性研究提供关联性证据表明，CdSO₄暴露伴随NIT-1细胞和小鼠胰腺组织中铁死亡相关氧化还原/铁失衡及特定m5C调控蛋白丰度改变。这些发现不应被解释为内部镉负荷-反应关系或m5C介导铁死亡直接机制的证明。未来研究应整合血清、全胰腺和分离胰岛中镉定量与匹配的功能、生化、表观转录组和遗传干预实验，以检验m5C相关改变是否在机制上调控铁死亡相关胰腺损伤。该论文发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。