《Ecotoxicology and Environmental Safety》：The effects of different types of micro/nano-plastics on the spread of antibiotic resistance genes in soil-lettuce systems
编辑推荐：
微/纳米塑料在土壤中普遍存在且持久，可作为抗生素抗性传播的潜在载体。本研究将不同类型和尺寸的微塑料和纳米塑料引入黄土和黑土，以探究它们对土壤-生菜系统内抗生素抗性基因（ARGs）分布的影响，并识别关键驱动因素。结果表明，与纳米塑料添加相比，微塑料添加更显著地增
微/纳米塑料在土壤中普遍存在且持久，可作为抗生素抗性传播的潜在载体。本研究将不同类型和尺寸的微塑料和纳米塑料引入黄土和黑土，以探究它们对土壤-生菜系统内抗生素抗性基因（ARGs）分布的影响，并识别关键驱动因素。结果表明，与纳米塑料添加相比，微塑料添加更显著地增强了ARGs在土壤-生菜系统中的传播，在根际土壤（22.46%–233.15%）、生菜根（17.22%–284.72%）和叶（0.26%–1428.58%）中观察到ARG丰度增加。聚乙烯颗粒在促进acrB抗性基因从根向叶转移方面表现出更强的能力，其增加倍数范围为3.00–13.87倍，优于聚丙烯（1.79–4.70倍）和聚苯乙烯（?0.66–4.55倍）。氨氮、硝态氮、有机质含量和pH值被确定为影响ARG丰度的主要因素，这些环境参数与土壤类型密切相关。移动遗传元件（MGEs）和细菌群落在ARGs于土壤-生菜系统内的转化和迁移中发挥关键作用，而放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）是土壤中ARGs的关键潜在宿主。
**研究背景与问题**
自1943年青霉素临床应用以来，抗生素在农业、畜牧业及人类疾病防治中广泛使用，其选择性压力促使抗生素抗性基因（ARGs）的产生与传播。抗生素耐药性已成为全球性挑战，严重威胁人类和动物健康、食品安全及全球经济。土壤是抗生素抗性细菌（ARB）和ARGs的丰富储存库，也是其发展、扩散和演化的关键生境。微塑料因其高产量、不当处置和强抗降解性，在土壤中普遍存在且持久，不仅可作为抗生素抗性传播的载体，还能增强ARGs的水平基因转移潜力。然而，不同粒径和类型的微/纳米塑料（M/NPs）对ARGs的影响存在复杂的尺寸依赖性效应，且老化过程会改变塑料表面性质，进一步影响其与ARGs和微生物群落的相互作用。此外，动物粪便作为抗生素、ARGs和ARB的重要储存库，其长期施用导致农业土壤中ARGs和微塑料广泛积累，改变土壤性质并增加健康风险。土壤性质（如pH、有机质、氮素等）通过多种机制影响微生物群落结构与功能，从而调控ARGs的分布与传播。可食用蔬菜是ARGs进入人体的关键途径，叶菜类蔬菜对ARGs的吸收能力较强。因此，研究不同类型微/纳米塑料在不同土壤条件下对蔬菜吸收ARGs的影响，对于理解污染物通过食物链向人类传递至关重要。
**研究内容与结论**
研究人员将三种常见微/纳米塑料——聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）——以100 μm（微塑料，MPs）和100 nm（纳米塑料，NPs）的粒径，分别添加至长期施用有机肥的黄土和黑土中，种植生菜，系统探究了M/NPs对土壤-生菜系统中ARGs分布、迁移及关键驱动因素的影响。研究结论表明：微塑料添加比纳米塑料添加更显著地促进了ARGs在土壤-生菜系统中的传播，导致根际土壤、生菜根和叶中的ARG丰度分别增加22.46%–233.15%、17.22%–284.72%和0.26%–1428.58%。聚乙烯颗粒在促进acrB抗性基因从根向叶转移方面效果最强（增加3.00–13.87倍），优于聚丙烯（1.79–4.70倍）和聚苯乙烯（?0.66–4.55倍）。氨氮、硝态氮、有机质含量和pH值被确定为主要影响ARG丰度的因素，且这些环境参数与土壤类型密切相关。移动遗传元件（MGEs）和细菌群落在ARGs的转化和迁移中发挥关键作用，其中放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）是土壤中ARGs的主要潜在宿主。该研究论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。
**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：1）土壤和生菜样品采集：根际土壤通过刷取紧密附着于根部的土壤获得，生菜根和叶经表面灭菌处理（乙醇、次氯酸钠、乙醇逐级浸泡并验证无菌）。2）土壤理化性质测定：pH值（电极法）、有机质（重铬酸钾氧化-分光光度法）、有效磷（钼锑抗分光光度法）、硝态氮和氨氮（氯化钾提取-分光光度法）。3）生菜生物量和营养成分测定：鲜重、根长、叶长、可溶性糖（蒽酮比色法）和维生素C（2,6-二氯靛酚滴定法）。4）DNA提取：使用FastDNA SPIN Kit for Soil提取根际土壤及生菜根、叶内共生菌DNA。5）实时荧光定量PCR（qPCR）检测：检测11个ARGs（包括多药外排泵基因acrB、磺胺类耐药基因sul1/sul2、四环素类耐药基因tetA/tetM/tetQ/tetW、β-内酰胺类耐药基因blaOXA/blaTEM、氨基糖苷类耐药基因aadA1/strB）及移动遗传元件整合酶基因intI1。6）16S rRNA基因高通量测序：扩增V5-V7区，在Illumina NovaSeq平台测序，经QIIME2流程分析获得扩增子序列变异体（ASVs）。7）统计分析：方差分析、Pearson相关性分析、冗余分析（RDA）、共现网络分析（Spearman相关系数，p<0.05，R≥0.6）及中性群落模型（NCM）分析。样本来源：黄土采集于重庆开县，黑土采集于吉林长春，均为长期施用有机肥的农田表层0-20 cm土壤。
**研究结果**
**3.1 老化微/纳米塑料的特征** 扫描电子显微镜（SEM）结果显示，PE-MPs出现局部融合和重结晶，PP-MPs表面出现不规则凹坑和皱纹，PS-MPs出现脆性裂纹；PE-NPs和PP-NPs产生低分子量产物形成聚集体，PS-NPs无明显变化。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）显示，老化后PE-NPs出现C-O伸缩振动峰（1117 cm
-1），PP-MPs和PP-NPs出现C=O伸缩振动峰（1725、1730 cm
-1），PS-MPs也出现羰基峰，表明表面含氧官能团增加。
**3.2 根际土壤性质及生菜生物量和营养成分变化** 添加M/NPs后，黄土根际土壤pH显著升高（PS-M/NPs轻微升高），黑土pH略有下降（PS-M/NPs）。氨氮在黄土中无显著变化，黑土中受不同程度影响；有效磷在黄土中显著降低，黑土中无显著变化。生菜鲜重、根长、叶长均降低，其中黑土生菜鲜重和叶长高于黄土。黑土中PE、PP、PS的M/NPs显著降低叶可溶性糖含量，黄土中仅PP-M/NPs引起显著降低。维生素C含量在黑土中除PS-MPs外均显著降低，黄土中仅PP-NPs和PP-MPs显著降低。
**3.3 M/NPs胁迫下土壤和生菜中ARGs和MGEs的分布特征** 总ARGs相对丰度在根际土壤、根和叶中分别为5.90×10
-2至8.45×10
-1、3.24×10
-2至5.71×10
-1和8.75×10
-3至3.79×10
-1；整合子intI1丰度分别为3.03×10
-7至4.01×10
-2、2.39×10
-7至2.10×10
-3和1.27×10
-6至2.83×10
-4。微塑料添加比纳米塑料更显著增加ARG丰度（根际土22.46%–233.15%，根17.22%–284.72%，叶0.26%–1428.58%）。PE和PP的M/NPs显著增加acrB和blaTEM基因丰度（p<0.05），而PS纳米塑料显著降低acrB、aadA1、blaTEM和intI1丰度（p<0.05）。生菜组织中，PE颗粒使叶中acrB丰度增加3.00–13.87倍，高于PP（1.79–4.70倍）和PS（?0.66–4.55倍）。冗余分析（RDA）显示，氨氮对ARGs变化的解释力最高，与acrB和sul2显著正相关（p<0.05）；硝态氮与tetQ显著正相关；pH与sul1和blaOXA正相关，与acrB负相关；有机质也是重要影响因子。Pearson相关分析表明，intI1与多个ARGs（如tetW、tetQ、sul1、sul2、blaOXA等）在根际土、根和叶中显著相关（p<0.05）。
**3.4 M/NPs对细菌群落分布和多样性的影响** 基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示，根际土壤细菌群落明显分为黄土和黑土两个簇（PCoA1解释2.6%，PCoA1+PCoA2解释48.8%），黑土中不同塑料处理组间显著分离（p<0.05），而NPs和MPs处理组重叠。生菜根和叶内共生菌群落无明确分离。M/NPs处理增加了黄土中变形菌门（Proteobacteria）比例（PE处理最明显），黑土中PP和PS处理效果更显著。生菜叶中，黄土组变形菌门比例增加，黑土组变形菌门比例下降而厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteriota）比例增加。α多样性（Chao1和Shannon指数）显示，土壤细菌多样性高于生菜组织，根组织高于叶组织。PE-M/NPs显著降低黑土中土壤细菌和生菜内共生菌的α多样性，且NPs抑制作用强于MPs。
**3.5 细菌、MGEs和ARGs的共现模式** 网络分析显示，根际土壤共现网络包含89个节点和85条边，细菌分属14个门，其中变形菌门、放线菌门和芽单胞菌门（Gemmatimonadota）最丰富。sul2和blaOXA是根际土中潜在宿主最多的ARGs。生菜根网络包含79个节点和88条边，blaTEM、tetQ和sul2是潜在宿主最多的ARGs，额外涉及脱硫杆菌门（Desulfobacterota）和异常球菌-栖热菌门（Deinococcota）。生菜叶网络包含30个节点和21条边，放线菌门和变形菌门是ARGs的主要潜在宿主，叶组织中潜在宿主细菌少于根组织。
**3.6 群落组装机制和生态位宽度** 中性群落模型（NCM）拟合显示，黄土和黑土根际细菌群落中，随机过程的主导作用较强（Rsqr值高），而生菜内部细菌群落拟合度较低（Rsqr<0.5），黑土生菜叶内共生菌拟合度最低（Rsqr=?0.007），表明确定性选择压力主导生菜内部细菌群落组装。黑土生菜根N
m值（67）高于黄土（10），表明黑土生菜根际内共生菌扩散能力更强。生态位宽度方面，黄土组叶内共生菌在三种塑料处理下无显著变化，黑土组叶内共生菌生态位宽度在PS处理后显著增加（p<0.05），顺序为PS>PP>PE；根内共生菌和根际土壤细菌在PS处理下生态位宽度也显著增加（p<0.05）。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，长期施用粪肥的土壤中ARGs通过粪源引入并借助土壤细菌侵入植物组织而迁移至生菜。M/NPs通过改变土壤理化性质（如氨氮、硝态氮、有机质和pH）影响ARGs丰度，不同土壤类型导致差异。微塑料（100 μm）比纳米塑料（100 nm）更显著促进ARGs传播，归因于纳米塑料的毒性效应降低细菌活性，而微塑料通过提供载体和增加细胞膜通透性促进水平基因转移。PE颗粒比PP和PS更有效促进acrB从根向叶转移，与PE表面粗糙、高疏水性和抗降解性相关。MGEs（特别是intI1）与多种ARGs显著相关，介导水平基因转移。M/NPs改变细菌群落结构，选择富集特定微生物（如变形菌门和放线菌门），这些细菌作为ARGs的潜在宿主，影响ARGs的分布与传播。随机过程主导土壤细菌群落组装，而确定性过程主导生菜内共生菌群落。生菜组织内ARG丰度从根际土到根到叶递减，与植物器官过滤效应一致。
**结论：** 在长期施用粪肥的土壤-生菜系统中，ARGs存在迁移和传播风险。M/NPs的添加改变了土壤的理化性质和微生物群落结构，从而影响其传播，其中放线菌门和变形菌门是土壤中ARGs的主要潜在宿主。与100 nm NPs相比，100 μm MPs的添加更显著地促进了ARGs在土壤-生菜系统中的传播。聚乙烯颗粒比聚丙烯和聚苯乙烯更有效地促进acrB抗性基因从根向叶的转移，表现出更强的促进作用。氨氮、硝态氮、有机质含量和pH值是影响ARGs丰度的主要因素，这些因素均与土壤类型相关。农田土壤含有不同老化和尺寸的塑料，未来研究应考虑更多从纳米到微米尺度的粒径以及不同老化程度的塑料，以进一步了解M/NPs对蔬菜和食品安全的影响。
