在合成囊性纤维化培养基中培养金黄色葡萄球菌促进小鼠肺炎模型中的定植

《Infection and Immunity》：Growing Staphylococcus aureus in synthetic cystic fibrosis medium promotes colonization in a murine pneumonia model

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球细菌感染的主要原因之一，可导致人类骨髓炎、皮肤和肺部感染等疾病。小鼠感染模型一直是研究金黄色葡萄球菌（S. aureus）毒力的重要工具，尽管存在局限性。在小鼠肺炎模型中，金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染通常难以维持。研究人员假设，在不同条件下培养金黄色葡萄球菌（S. aureus），例如在合成囊性纤维化培养基2（SCFM2）中培养，相比在标准富集培养基琼脂平板上培养，可增加细菌呼吸道负荷量。研究人员观察到，将来自不同来源的六株金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株在SCFM2中培养后，与在琼脂平板上培养相比，其肺部细菌负荷量呈中性或增加水平。聚焦于WU1菌株，研究人员发现，与琼脂平板相比，在SCFM2中培养改善了细菌在口咽部的持续存在，并导致持续的长时程肺部感染。研究人员进一步注意到，当感染在SCFM2中培养的WU1时，小鼠两肺叶的炎症反应均较琼脂平板培养时增强。总体而言，研究人员已证明，感染前在不同条件下培养金黄色葡萄球菌（S. aureus）会影响定植水平和宿主反应。

**论文解读：合成囊性纤维化培养基促进金黄色葡萄球菌在小鼠肺炎模型中的定植与宿主反应**

**研究背景与问题**
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是一种革兰氏阳性机会致病菌，是全球细菌感染的主要病原体之一，可导致骨髓炎、心内膜炎、皮肤及肺部感染。约30%的人群鼻腔中无症状携带该菌。小鼠模型是研究S. aureus感染的重要工具，具有体型小、易繁殖、成本低及免疫系统明确等优势。然而，在小鼠肺炎模型中，S. aureus感染通常难以维持，大多数研究需经鼻内给予超生理剂量（10⁷–10⁸ CFU）才能建立感染，低于此阈值常导致细菌被清除而非持续感染。为改善感染持续性，研究者曾探索多种方法，如将S. aureus包埋于琼脂珠中经气管内给药（可延至21天）、使用免疫抑制剂环磷酰胺（cyclophosphamide）耗竭中性粒细胞，或采用小鼠来源菌株。但这些方法存在局限性，尤其包埋琼脂珠无法准确模拟囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）等临床感染。CF是一种多器官遗传病，影响全球超12万人，由CF跨膜传导调节因子（CFTR）突变导致，患者肺部黏液清除障碍，痰液积聚成为病原体营养源，S. aureus是最常从CF患者呼吸道样本中分离的细菌，可持续定植肺部。因此，开发更贴近临床的S. aureus肺部感染模型至关重要。本研究旨在探究感染前不同培养条件对S. aureus呼吸道负荷及宿主反应的影响，假设在模拟CF患者痰液营养组成的合成CF培养基2（Synthetic CF Medium 2, SCFM2）中培养S. aureus，可增加小鼠肺炎模型中的细菌负荷与持续定植能力。该研究发表于《Infection and Immunity》。

**主要技术方法**
研究人员使用了六株S. aureus菌株（五株人源、一株鼠源），分别来自不同克隆复合体（CC），包括CC8、CC5、CC45和CC88，并进行了基因组平均核苷酸相似性（ANI）分析和系统发育分析。关键方法包括：在LB琼脂平板或SCFM2中静态培养细菌，制备菌悬液（约1×10⁸ CFU/25 μL），经鼻内接种至8–10周龄雌性C57BL/6或Balb/c小鼠（来源：Jackson Laboratories）。通过肺部匀浆、鼻腔灌洗及口咽拭子测定细菌负荷量；采用组织病理学（H&E染色）评估炎症；利用MesoScale Discovery平台检测肺叶中10种细胞因子水平。

**研究结果**

**1. 本研究所用S. aureus菌株表现临床与基因组多样性**
通过ANI分析和系统发育树，发现六株菌株共有核心基因组2,216个基因，附属基因组809个基因，其中Sa_CFBR_46（CC45）拥有最多独有基因（119个），WU1（CC88）拥有36个独有基因。JE2、Newman和Sa_CFBR_43（均为CC8）基因组相似度>99.9%。

**2. S. aureus菌株在SCFM2和LB中生长动力学比较**
所有菌株在LB和SCFM2中静态培养的前8小时生长速率相似，24小时时CFU计数无显著差异，表明培养基选择不显著改变生长动力学。

**3. 在SCFM2中培养S. aureus可增加多数菌株的肺部细菌负荷**
与琼脂平板培养相比，SCFM2培养的Sa_CFBR_43、Sa_CFBR_46、N315和WU1在两种小鼠品系中均显著增加肺部细菌负荷（P<0.001至P<0.0001），而JE2和Newman无显著差异。鼻腔负荷变化呈菌株特异性：CF分离株（Sa_CFBR_43和Sa_CFBR_46）在SCFM2培养后鼻腔负荷降低，而N315和WU1则升高。

**4. 在SCFM2中培养WU1增加喉咙和肺部的细菌持续存在**
选择WU1与Balb/c小鼠组合（因24小时肺部负荷高且一致），追踪感染后1–14天。SCFM2培养的WU1在感染后第1天和第2天口咽部细菌负荷显著高于琼脂平板培养（P<0.05），第3天后无差异。肺部持续监测显示，SCFM2培养的WU1在感染后1–4天均维持显著更高的肺部负荷（P<0.001），表明其增强了细菌在肺部的持续存在能力。

**5. 与琼脂条件相比，感染SCFM2培养的WU1导致炎症增加和细胞因子谱改变**
组织病理学显示，SCFM2培养的WU1感染导致两肺叶更严重的炎症，以多形核白细胞（PMN）浸润为主，评分达“严重”级别，而琼脂平板培养为“中度至重度”。细胞因子分析发现，SCFM2培养的WU1感染后，右肺叶中IL-6、TNF-α、KC/GRO、IL-1β、IL-2和IL-5水平显著升高（P<0.05至P<0.0001），左肺叶中KC/GRO显著升高，但TNF-α、IL-12p70和IFN-γ则显著降低。总体而言，SCFM2培养条件增强了炎症反应和中性粒细胞募集，与组织病理学结果一致。

**讨论与结论**
本研究证明，在S. aureus鼠肺炎模型中，感染前培养条件、菌株选择及小鼠品系三者相互作用共同影响肺部细菌负荷。SCFM2培养可显著提高部分菌株（尤其是呼吸道来源菌株如N315和WU1）的肺部负荷，但JE2和Newman未受影响，提示菌株特异性差异可能源于附属基因差异（如Sa_CFBR_43的独有基因）。WU1（鼠源菌株）在Balb/c小鼠中表现出更持久的定植，且SCFM2培养后两肺叶细菌分布均匀，但细胞因子反应存在叶间差异，提示测量宿主反应时宜使用全肺而非单叶。SCFM2单独给药可诱导免疫细胞浸润，可能与培养基成分（如黏蛋白、DNA）的促炎特性有关。研究结论：在SCFM2中培养S. aureus可改善小鼠呼吸道感染模型中的细菌负荷和持续定植能力，同时增强宿主炎症反应，为未来研究S. aureus在CF相关肺部感染中的致病机制提供了优化模型策略。但需注意，SCFM2培养并未使所有菌株获益，且经鼻内给药后的细菌清除仍普遍存在，未来需探索气管内给药、人源化小鼠模型及转录组/蛋白质组学机制。