《Infection and Immunity》：Dual roles of genes required for intrinsic resistance to clarithromycin in evasion of killing by serum complement in Haemophilus influenzae
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大环内酯类抗生素常用于治疗流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）呼吸道感染。以往研究主要关注新兴的获得性大环内酯耐药性H. influenzae菌株，而该菌对抗生素的内在耐药性（intrinsic resistance）则研究不足。本研究
大环内酯类抗生素常用于治疗流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）呼吸道感染。以往研究主要关注新兴的获得性大环内酯耐药性H. influenzae菌株，而该菌对抗生素的内在耐药性（intrinsic resistance）则研究不足。本研究采用全基因组范围的转座子插入位点测序（transposon insertion-site sequencing, Tn-seq）方法，筛选在亚抑菌浓度（sub-inhibitory concentrations, sub-MIC）的大环内酯类抗生素克拉霉素（clarithromycin, CLR）中培养的H. influenzae突变体文库，鉴定出33个参与内在CLR耐药性的基因。这些基因中近一半也是在鼠肺中生存所必需的。研究人员重点关注了对内在大环内酯耐药性和肺内生存均必需的候选基因。其中两个基因orfH和omp26影响H. influenzae的外膜组成。在Rd菌株及非分型H. influenzae临床分离株Hi375和NT127中，这些基因的缺失导致菌株对CLR和多粘菌素B（polymyxin B）敏感，并增加了对溴化乙锭（ethidium bromide, EtBr）的膜通透性。omp26突变体对人血清杀伤敏感。在过表达多药外排泵（multidrug efflux pump）的acrR突变体菌株中，缺失orfH或omp26消除了该突变体对CLR的耐药性，并恢复了对EtBr的通透性。因此，这些基因的缺失不仅减轻了获得性耐药机制的影响，而且显著地将其抑制。对这些缺失突变体进行互补回补，则恢复了CLR耐药性并降低了对EtBr的通透性。研究结果表明，这一类在内在耐药性和宿主肺内生存中具有双重作用的基因，可能成为潜在的新型联合抗菌治疗靶点。
**论文解读：流感嗜血杆菌内在克拉霉素耐药性基因在补体杀伤逃逸中的双重作用**
**研究背景与问题**
流感嗜血杆菌（*Haemophilus influenzae*）是一种革兰氏阴性菌，可在健康人群鼻咽部定植，并导致多种呼吸道感染，尤其是非分型流感嗜血杆菌（NTHi）是慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重和中耳炎的主要病原体之一。临床上常用β-内酰胺类抗生素如阿莫西林治疗，但约30%的临床分离株因产β-内酰胺酶或其他机制而耐药。大环内酯类抗生素，如克拉霉素（CLR）和阿奇霉素，是治疗急性加重COPD的一线药物之一。然而，近40%的临床分离株对CLR耐药，且治疗过程中可诱导耐药性产生。H. influenzae对大环内酯类的耐药性包括获得性机制（如靶点修饰、外排泵上调）和内在机制。尽管已知acrAB外排泵的正常表达参与内在耐药，但此前尚无在全基因组水平上系统评估H. influenzae内在CLR耐药性的研究。因此，本研究旨在回答：哪些H. influenzae基因是CLR内在耐药性的决定因子，以及这些基因能否作为靶点来削弱获得性耐药性？
**研究内容与结论**
研究人员采用全基因组范围的转座子插入位点测序（Tn-seq，一种高通量插入追踪测序技术）技术，在亚抑菌浓度（sub-MIC）的CLR中筛选H. influenzae Rd菌株的突变体文库，鉴定出33个影响CLR耐药性的基因。其中，近一半的基因（14个）也在小鼠肺部感染模型中为生存所必需。研究人员重点关注了同时参与内在耐药性和肺内生存的候选基因，特别是影响外膜组成的orfH和omp26。通过构建orfH和omp26的缺失突变体，研究人员在Rd菌株及两种NTHi临床分离株（Hi375和NT127）中验证了其对CLR耐药性的贡献。有趣的是，在通过敲除acrR基因（产生截短型AcrR蛋白，导致acrAB外排泵过表达）而获得耐药性（AcrR′）的Rd菌株中，缺失orfH或omp26能够显著降低其MIC值，几乎完全消除由外排泵过表达介导的耐药性。机制研究表明，orfH和omp26的缺失增加了外膜通透性，使CLR更易进入细胞。此外，研究人员发现omp26缺失突变体对人血清补体杀伤更为敏感，表明该基因在免疫逃逸中发挥作用。最后，研究显示，在亚抑菌浓度CLR预处理后，orfH、omp26和HI0461的缺失突变体对多粘菌素B（一种模拟宿主抗菌肽的模型）的敏感性增加。
该研究最重要的意义在于揭示了H. influenzae中存在一批在内在抗生素耐药性和宿主免疫逃逸中发挥双重作用的基因。靶向这些基因可能同时实现两重效果：增强抗生素疗效和削弱细菌的感染能力。这为开发与CLR联用的新型联合抗菌疗法提供了新的潜在靶点，并可能降低耐药突变逃逸的频率。该论文发表在《Infection and Immunity》。
**关键技术与方法**
1. **全基因组筛选技术**：采用转座子插入位点测序（Tn-seq）技术，构建了包含超过70,000个突变的H. influenzae Rd菌株突变体文库。在亚抑菌浓度（sub-MIC）的CLR中培养文库，通过比较CLR处理组与对照组（化学限定培养基CDM）中各突变体的丰度变化，鉴定出影响内在耐药性的基因。同时，通过小鼠肺部感染模型，利用Tn-seq筛选出在体内生存必需的基因。
2. **基因功能验证**：通过重叠PCR和同源重组技术，构建了orfH、omp26和HI0461基因的非极性、无标记缺失突变体，并利用含木糖诱导启动子的pXT10载体进行基因互补回补。通过精确的微量肉汤稀释法（modified Gompertz function拟合）测定CLR的最小抑菌浓度（MIC），结合溴化乙锭（EtBr，一种外排泵底物）累积荧光检测评估外膜通透性，验证基因的功能。
3. **免疫逃逸与协同效应评估**：采用正常人血清（NHS，样本来源：商业公司）进行血清杀菌试验，评估Omp26在补体抵抗中的作用。采用纸片扩散法，评估亚抑菌浓度CLR预处理对多粘菌素B（一种抗菌肽模型）敏感性的影响。
**研究结果**
**1. 鉴定H. influenzae中CLR内在耐药性基因**
通过Tn-seq筛选，在1/2 MIC（高浓度）和1/4 MIC（低浓度）CLR条件下，共鉴定出33个影响CLR耐药性的基因，其中30个基因的缺失导致耐药性下降（即对CLR更敏感），3个基因（hxuB, rhlB, acrR）的缺失反而增强了耐药性。这些基因功能涉及细胞壁/外膜、氧化应激、转运/外排、转录和翻译四大类。其中，5个基因（orfH, HI0461, omp26, sapF, HI0310）在两种CLR浓度下均为必需。
**2. 耐药基因在鼠肺感染中的作用**
通过小鼠肺部感染模型，研究人员发现33个影响CLR耐药性的基因中，有14个也是鼠肺感染所必需的。所有在低浓度CLR下必需的或有害的基因均在鼠肺模型中也必需，提示肺部的某些选择性压力可能与低浓度CLR产生的压力相似。
**3. 泛基因组分析**
基于112个高质量H. influenzae基因组构建的泛基因组分析显示，33个影响CLR耐药性的基因中有76%（25个）属于核心基因组（core genome），18%（7个）属于外核心基因组（outer core），表明大多数CLR耐药相关基因在H. influenzae中高度保守。
**4. 验证CLR耐药性决定因子**
在Rd和Hi375菌株中，对orfH、omp26和HI0461基因进行缺失突变，MIC测定证实除RdΔomp26（在竞争环境中才表现出敏感性）外，其余突变体对CLR的敏感性均增加至少2倍，验证了Tn-seq筛选结果。
**5. 不同菌株背景下的缺失效应**
在Rd、Hi375和NT127三种野生型菌株中，缺失orfH或omp26均导致CLR敏感性增加，但效应存在菌株依赖性。对NT127菌株的影响最大，而对Hi375影响最小。在AcrR′（过表达外排泵）背景中，缺失orfH或omp26可使MIC值降低35.7%-42.8%，几乎完全逆转了AcrR′突变带来的耐药性，而互补回补可部分或完全恢复耐药性。
**6. AcrR′背景下突变体敏感性增加的机制**
EtBr累积实验表明，在AcrR′背景下，缺失orfH或omp26的突变体比AcrR′亲本菌株累积更多的EtBr，表明外膜通透性增加是导致其CLR敏感性升高的机制。
**7. Omp26在血清抵抗中的作用**
血清杀菌试验表明，在Rd、Hi375和NT127三种菌株中，缺失omp26均导致菌株对人血清补体杀伤的敏感性显著增加，互补回补后恢复至野生型水平，证明Omp26是H. influenzae抵抗补体杀伤所必需的。
**8. 亚抑菌浓度CLR治疗对多粘菌素B耐药性的影响**
纸片扩散试验显示，在亚抑菌浓度CLR预处理的条件下，Hi375菌株中orfH、omp26和HI0461的缺失突变体对多粘菌素B的敏感性相比未处理组均有增加，且orfH和HI0461突变体的敏感性增加程度高于亲本菌株，表明CLR处理与这些基因的缺失可协同增强抗菌肽敏感性。
**讨论与结论**
**讨论部分总结**：研究结果表明，H. influenzae对CLR的内在耐药性涉及多个基因，且与肺部感染所需基因存在显著重叠，表明CLR的效应可能部分反映了肺环境的选择压力。这些具有双重作用的基因（如影响外膜的orfH、omp26）是极具吸引力的药物靶点，因为靶向它们不仅能增强抗生素疗效，还能削弱细菌的免疫逃逸能力，降低耐药突变逃逸的风险。orfH和omp26的缺失效应具有菌株依赖性，可能与脂寡糖（LOS）结构差异或外膜蛋白的等位基因变异有关。此外，亚抑菌浓度CLR处理可增强某些突变体对抗菌肽的敏感性，提示在体内可能存在协同效应。研究还发现了一些新的耐药相关基因，如核糖体蛋白L9（与翻译保真度相关）和多个氧化应激相关基因（如metNI、recA），拓展了对大环内酯类耐药机制的理解。鉴于临床中持续使用大环内酯类药物治疗COPD会导致耐药，靶向这些内在耐药性基因的联合疗法有望解决当前耐药问题。
**研究结论翻译**：总的来说，研究人员鉴定了H. influenzae中新的内在耐药性基因，这些基因参与细胞壁和外膜生物合成与修饰、氧化应激、转运/外排、转录和翻译。此外，研究人员还发现一大类内在CLR耐药性决定因子也参与毒力表型，包括补体抵抗。未来需要进一步研究明确这些基因介导免疫逃逸的具体机制，并将研究扩展到耐大环内酯类药物的临床分离株。最终，这些数据可能有助于设计与大环内酯类抗生素联用的新联合疗法。
