整合计算毒理学与实验验证揭示磷酸三苯酯诱导雌性生殖毒性中ESR1介导的类固醇生成干扰

《Environment International》：Integrative computational toxicology and experimental validation unveils ESR1-mediated steroidogenic disruption in triphenyl phosphate-induced female reproductive toxicity

　　

整合计算毒理学与实验验证揭示了磷酸三苯酯（TPHP）诱导的雌性生殖毒性中ESR1介导的类固醇生成干扰。研究人员采用网络毒理学和九种机器学习模型，优先确定了ESR1作为不良结局通路（AOP）的分子起始事件（MIE）。外部人类数据支持ESR1与生殖结局的相关性（AUC = 0.94）。ESR1敲低为ESR1-STAR-孕酮轴提供了功能证据。该研究建立了一个综合计算毒理学架构，整合了网络毒理学、基因表达综合数据库（GEO）转录组分析、机器学习算法、AOP构建、分子对接模拟和体外验证实验，系统评估了TPHP干扰雌性生殖功能的潜力，并绘制了从分子起始事件（MIE）、关键事件（KE）扰动到细胞结局级联的毒性表现图谱。实验验证表明，TPHP在50 μM浓度下显著降低类固醇生成急性调节蛋白（STAR）的表达和孕酮分泌，但总ESR1蛋白丰度未见显著下降。ESR1敲低实验证实了ESR1在STAR依赖性孕酮合成中的必要性，且TPHP在ESR1敲低条件下未进一步抑制这些终点，支持ESR1相关、STAR依赖的途径在TPHP诱导的类固醇生成干扰中的作用。该研究建立的机器学习驱动的MIE识别范式为AOP构建提供了客观、可复现的标准，为新兴环境污染物的机制解读和风险评估提供了系统方法。

**论文解读：整合计算毒理学与实验验证揭示TPHP诱导雌性生殖毒性的ESR1介导机制**

**研究背景与问题**

随着传统溴代阻燃剂（BFRs）因对人类健康的不良影响而被逐步禁用，有机磷阻燃剂（OPFRs）成为主要替代品。磷酸三苯酯（TPHP）作为典型的OPFR，广泛用于聚氯乙烯、印刷电路板、粘合剂、橡胶及化妆品（如指甲油）等产品。由于TPHP是添加型阻燃剂，未与产品化学结合，极易释放到环境中，属于持久性有机污染物（POPs），难以降解，可通过食物链生物累积。人群主要通过空气吸入、粉尘摄入、饮食摄入和皮肤吸收暴露于TPHP。流行病学与动物研究表明，TPHP暴露与雌性生殖毒性相关，但其确切分子机制尚不清楚。传统毒理学机制研究依赖动物模型，存在实验周期长、成本高、低通量等局限，难以进行多靶点综合分析，且未能建立从分子相互作用、细胞响应到组织效应、器官功能障碍及个体表现的跨尺度整合框架。因此，亟需发展先进的计算模型和高通量筛选平台，建立系统化的毒理学评估框架。

**研究内容与结论**

研究人员开发了一种综合计算范式，结合网络毒理学、基因表达综合数据库（GEO）转录组分析、九种机器学习算法、不良结局通路（AOP）构建、分子对接模拟及体外实验验证。通过网络毒理学分析，从比较毒理基因组学数据库（CTD）、OMIM、Open Targets和GeneCards等数据库获取TPHP与雌性不孕相关基因，经蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，利用MCODE、CytoNCA和CytoHubba三种插件筛选出七个枢纽基因（AR、CYP19A1、ESR1、ESR2、IGF1、INS、STAR）。功能富集分析显示这些基因涉及雌激素信号通路、卵巢类固醇生成、孕酮介导的卵母细胞成熟等关键生殖过程。基于GEO数据集GSE241995（TPHP处理的人卵巢颗粒细胞KGN）的转录组分析，结合九种机器学习模型（随机森林RF、极端梯度提升XGB、K近邻KNN、广义线性模型GLM、线性判别分析LDA、分量线性梯度提升GLMBoost、Lasso回归LR、朴素贝叶斯NB、支持向量机SVM），筛选出核心基因ESR1。外部验证数据集GSE272778（来自29例既往胚胎移植失败患者的子宫内膜组织）显示，ESR1预测AUC达0.9429，证实其作为生物标志物的稳健性。分子对接模拟显示TPHP与ESR1结合能为-8.01 kcal/mol，形成氢键和疏水相互作用，支持其作为分子起始事件（MIE）。体外实验采用KGN细胞，TPHP暴露（50 μM）显著降低STAR蛋白表达和孕酮分泌，但未显著改变总ESR1蛋白水平；ESR1敲低实验证实ESR1缺失抑制STAR表达和孕酮产生，且TPHP在敲低条件下无叠加效应，表明ESR1对维持STAR依赖性类固醇生成至关重要。研究构建了从TPHP抑制雌激素受体活性（MIE）到STAR降低、线粒体胆固醇转运减少、孕酮合成减少、卵母细胞成熟和排卵受损，最终导致生育力下降的AOP框架，并基于OECD指南和AOP-Wiki对关键事件（KE）和关键事件关系（KER）进行了证据权重评估，均获得高置信度支持。

**主要技术方法**

研究采用以下关键技术方法：①网络毒理学分析，整合CTD、OMIM、Open Targets、GeneCards数据库数据，构建PPI网络并基于MCODE、CytoNCA、CytoHubba插件筛选枢纽基因；②GEO转录组数据分析，对GSE241995数据集进行差异表达分析和基因集富集分析（GSEA），并利用GSE272778数据集进行外部验证；③九种机器学习模型（RF、XGB、KNN、GLM、LDA、GLMBoost、LR、NB、SVM）训练与评估，基于残差分布、ROC曲线、精确率、召回率和F1分数筛选核心基因；④AOP构建遵循OECD手册，利用AOP-Wiki已有关键事件定义，进行证据权重评估；⑤分子对接模拟，采用盲对接、半柔性对接和柔性对接三阶段策略，使用AutoDock Vina和AutoDock 4.2计算结合能；⑥体外实验验证，采用KGN人卵巢颗粒细胞系，进行siRNA介导的ESR1敲低、Western blot检测蛋白表达、ELISA检测孕酮分泌。

**研究结果分节概述**

1. **靶基因识别与枢纽基因筛选**：通过Venn图获得24个TPHP与雌性不孕相关重叠基因，经PPI网络和三种插件分析，最终确定7个枢纽基因（AR、CYP19A1、ESR1、ESR2、IGF1、INS、STAR），这些基因主要涉及类固醇激素受体、胰岛素信号和类固醇生成途径。

2. **功能富集分析**：GO富集显示雌激素反应、生殖器官发育、类固醇结合等条目；KEGG通路富集显示卵巢类固醇生成、雌激素信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟等通路，提示TPHP通过干扰雌激素信号和类固醇生成导致雌性不孕。

3. **化学-基因-表型-疾病网络构建**：通过CTD获取TPHP和雌性不孕相关表型与通路，与富集结果取交集，获得13个表型和12条通路，构建网络图系统性展示TPHP起始的分子事件至不孕结局。

4. **转录组分析**：GSE241995数据集（KGN细胞暴露于50 μM TPHP 48小时）差异表达分析显示48个上调基因和98个下调基因，下调基因富集于DNA复制、细胞周期和孕酮介导的卵母细胞成熟通路；GSEA进一步确认抑制卵母细胞减数分裂和孕酮介导的卵母细胞成熟通路。

5. **机器学习核心基因识别**：利用枢纽基因与GSE241995差异基因交集（ESR1、STAR、AR），训练九种模型，随机森林（RF）模型性能最优，特征重要性分析显示ESR1和STAR为负向调控因子，AR为正向；外部验证（GSE272778）中ESR1的AUC为0.9429，优于其他组合，确定ESR1为核心基因。

6. **AOP框架构建与评估**：以TPHP为应激源，ESR1为MIE，构建了从抑制雌激素受体活性（MIE，事件ID:1046）→STAR降低（KE1，事件ID:266）→线粒体胆固醇转运减少（KE2，事件ID:447）→孕酮合成减少（KE3，事件ID:1692）→卵母细胞成熟和排卵受损（KE4，事件ID:1989）→生育力下降（AO，事件ID:406）的AOP。基于文献证据对KE和KER进行证据权重评估，均获得“高”或“中高”置信度。

7. **分子对接**：半柔性对接结合能-7.427 kcal/mol，与Asn455形成氢键；柔性对接结合能-8.01 kcal/mol，扩展了疏水相互作用网络，稳定结合支持TPHP作为ESR1配体干扰其功能。

8. **体外实验验证**：CCK-8显示100 μM TPHP降低细胞活力至80%以下，故使用≤50 μM浓度。Western blot显示50 μM TPHP显著降低STAR蛋白表达，但ESR1蛋白无显著变化；ELISA显示孕酮分泌在50 μM时显著减少。ESR1敲低实验（si-ESR1-3）显著降低STAR表达和孕酮分泌，且TPHP在敲低条件下无额外抑制，证实ESR1是STAR依赖性类固醇生成所必需的。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，网络毒理学鉴定的枢纽基因通过雌激素信号干扰、类固醇生成途径破坏和减数分裂成熟干扰三种机制参与TPHP生殖毒性。转录组分析揭示缺氧、DNA复制和细胞周期相关通路受抑制，与生殖毒性相关。提出的AOP框架具有机制合理性，得到人类和动物模型证据支持。分子对接证实TPHP与ESR1稳定结合，可能作为拮抗剂干扰其转录活性而不降低蛋白水平。体外实验支持ESR1在STAR依赖性孕酮合成中的关键作用，但需进一步研究TPHP是否通过竞争配体或干扰共调节因子招募发挥作用。研究局限性包括使用单一细胞系、未进行ESR1过表达拯救实验、未直接测定激动/拮抗活性、体外浓度高于人群内暴露水平。未来需结合环境监测和流行病学队列研究验证人群相关性。研究结论：网络毒理学和分子对接系统揭示了TPHP诱导雌性不孕的潜在分子机制，实验验证表明ESR1相关、STAR依赖途径参与TPHP诱导的类固醇生成干扰，机器学习驱动的MIE识别为AOP构建提供了客观可复现的标准，为新兴环境污染物的机制解读和风险评估提供了系统方法。该研究发表在《Environment International》。