细胞外膜囊泡——金黄色葡萄球菌生物膜中先前未被识别的组分

《Journal of Bacteriology》：Extracellular membrane vesicles—previously unrecognized components of Staphylococcus aureus biofilms

　　

摘要翻译：金黄色葡萄球菌是生物膜相关感染的主要病原体，其生物膜中细菌细胞群落被由多糖、蛋白质和细胞外DNA（eDNA）组成的细胞外基质包裹，从而保护细菌免受宿主免疫防御和抗生素的作用。尽管这些基质组分至关重要，但基质组分从细菌细胞释放并整合入生物膜基质的机制仍知之甚少。研究人员利用滴流式生物膜系统，发现膜囊泡（MVs）与金黄色葡萄球菌临床分离株MN8形成的生物膜基质相关。对生物膜基质蛋白和纯化MVs的蛋白质组学分析表明，源自生物膜的MVs携带的细胞质、膜和细胞外蛋白与生物膜基质的蛋白组成高度相似，但与浮游培养产生的MVs显著不同。源自生物膜的MVs携带的DNA水平显著高于浮游培养来源的MVs，且MV相关DNA对DNase处理敏感，提示eDNA主要结合于MV表面。尽管已知MN8菌株形成依赖多糖的生物膜，但外源添加DNase或蛋白酶K可显著损害生物膜形成和完整性。重要的是，补充源自生物膜的MVs（而非浮游培养来源的MVs）可显著恢复经酶处理的静态培养中的生物膜形成。综上，这些发现证明金黄色葡萄球菌MVs在生物膜内产生，并作为基质组分的重要来源，促进生物膜形成。

论文解读文章：

金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是引发生物膜相关感染的主要病原体，尤其在医疗植入物和骨髓炎等慢性感染中，其生物膜结构赋予细菌对宿主免疫和抗生素的强耐受性。生物膜细胞外基质（ECM）由多糖、蛋白质和细胞外DNA（eDNA）组成，但基质组分的释放和整合机制长期未明。既往研究多聚焦浮游培养条件下的膜囊泡（MVs），而革兰氏阳性菌生物膜中MVs的产生和功能几乎未被探索。本研究首次系统表征了金黄色葡萄球菌生物膜来源的MVs，揭示其作为基质组分关键载体的新角色。

研究人员采用滴流式生物膜系统培养金黄色葡萄球菌临床分离株MN8，通过透射电子显微镜（TEM）观察到MVs从菌体表面释放并大量存在于生物膜基质中。经OptiPrep密度梯度超速离心纯化获得生物膜来源MVs，纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示其平均粒径约80 nm，每个菌落形成单位（CFU）可回收约9个MV颗粒。蛋白质组学分析（LC-MS/MS）鉴定了生物膜基质中747种蛋白和生物膜MVs中730种蛋白，两者共享576种蛋白（约占基质蛋白的77%），且丰度呈显著正相关。亚细胞定位显示，生物膜MVs富含细胞质蛋白（占63.9%）和膜相关蛋白（29.5%），而浮游培养MVs中膜蛋白比例更高（45.3%）。差异分析发现，生物膜MVs中富集了金属离子结合蛋白和应激相关蛋白（如过氧化氢酶、烷基过氧化物还原酶C等），而浮游MVs则富集DNA结合、ATP结合和DNA重组相关蛋白。此外，生物膜MVs携带的eDNA量比浮游MVs高10倍以上；超速离心去除MVs后，生物膜匀浆中eDNA含量降低超过50%，且MV相关eDNA对DNase I敏感，提示eDNA主要结合于MV表面。糖聚合物检测显示，生物膜MVs不携带PNAG（多糖胞间黏附素），但携带8型荚膜多糖（CP8）和脂磷壁酸（LTA），且LTA在生物膜基质中主要与MVs相关。功能实验表明，DNase I或蛋白酶K处理显著降低MN8及其PNAG缺失突变株Δica的生物膜生物量，而添加生物膜来源MVs（非浮游MVs）可显著恢复酶处理后的生物膜形成；若预先用DNase或蛋白酶K处理MVs，则其恢复能力丧失，证明MV相关eDNA和蛋白是生物膜结构的关键组分。此外，通过比较MW2菌株及其PSM（苯酚可溶性调节素）突变株（Δpsmα/β/hld）的生物膜，发现PSM缺失突变株产生的MV数量是野生型的5倍以上，提示PSM可能通过裂解MVs促进生物膜分散。

本研究首次证明金黄色葡萄球菌生物膜内产生MVs，其蛋白和eDNA负载与生物膜基质高度一致，且MVs是基质组装的重要贡献者。该发现填补了革兰氏阳性菌生物膜MVs功能的认知空白，为理解生物膜形成机制和开发新型抗生物膜策略提供了新靶点。

主要技术方法：采用滴流式生物膜系统培养生物膜；通过OptiPrep密度梯度超速离心纯化MVs；TEM和NTA表征MV形态与粒径；LC-MS/MS蛋白质组学分析及生物信息学（PSORTb、GO富集）比较蛋白组成；eDNA定量（荧光法、琼脂糖凝胶电泳）；免疫点印迹检测PNAG、CP8和LTA；共聚焦显微镜结合COMSTAT2定量生物膜厚度和生物量；酶处理（DNase I、蛋白酶K）和MV回补实验评估功能；利用PSM突变株比较MV产量。

结果详述：
1. **滴流式生物膜系统中MVs的纯化**：通过TEM和密度梯度超速离心，从生物膜基质和流出液中均纯化获得MVs，平均粒径80 nm。
2. **生物膜基质与MVs的蛋白质组学分析**：共享576种蛋白，丰度高度相关，表明MVs是基质蛋白的主要来源。
3. **生物膜与浮游MVs蛋白质组的比较**：生物膜MVs含730种蛋白，浮游MVs含568种蛋白，410种共享，但生物膜MVs独有320种（多为细胞质蛋白），浮游MVs独有158种（多为膜蛋白和DNA代谢相关蛋白）。
4. **生物膜MVs相关eDNA分析**：生物膜MVs携带eDNA量显著高于浮游MVs，去除MVs后eDNA减少约50%，且eDNA可被DNase降解，提示表面结合。
5. **糖聚合物检测**：MVs含CP8和LTA，但不含PNAG；LTA在生物膜基质中主要与MVs相关。
6. **MVs在生物膜形成中的功能**：外源DNase或蛋白酶K抑制生物膜形成，生物膜MVs（而非浮游MVs）可恢复酶处理后的生物膜，且MV相关eDNA和蛋白起关键作用。
7. **PSM对MV产量的影响**：PSM缺失突变株产生的MV数量显著高于野生型，提示PSM可能裂解MVs促进分散。

讨论与结论：本研究证实金黄色葡萄球菌生物膜MVs是基质组分（eDNA、蛋白、LTA）的重要载体，并主动参与生物膜形成。MVs的蛋白组成受生长模式显著影响，生物膜MVs富含应激相关蛋白和金属离子结合蛋白，可能有助于细菌在生物膜环境中的适应。eDNA与MVs表面蛋白（如DNA结合蛋白）的相互作用可能是其整合入基质的关键机制。此外，PSM介导的生物膜分散可能通过裂解MVs释放降解酶实现。本研究为革兰氏阳性菌生物膜MVs的功能提供了首个直接证据，对理解生物膜感染和开发靶向MVs的治疗策略具有重要科学意义。论文发表于《Journal of Bacteriology》。