将壳聚糖固定化的磷脂酶D与混合胶束体系结合，用于高效合成磷脂酰丝氨酸

《Enzyme and Microbial Technology》：Combining a Chitosan-Immobilized Phospholipase D with a Mixed Micelle System for Highly Efficient Synthesis of Phosphatidylserine

　　

摘要

本研究利用磁性壳聚糖载体以及天然交联剂没食子苷，开发出一种高效固定的磷脂酶D（PLD）系统，即Fe₃O₄@CS-Gnp-PLD。通过系统表征确认该系统能够成功固定PLD，壳聚糖丰富的氨基和羟基可作为稳定的结合位点，从而提升酶的负载量并增强其稳定性。在以脱氧胆酸钠为基底的混合微胶束体系中，Fe₃O₄@CS-Gnp-PLD的磷脂酰丝氨酸转化率比游离PLD高8.05倍，这得益于更高的底物溶解度以及更好的酶可及性。这种固定化的酶表现出极高的操作稳定性，在6次重复使用后仍保持80%的活性，而在4℃下储存12天后仍有72%的活性。这一将壳聚糖基酶固定化技术与混合微胶束体系相结合的整合平台，为可持续的磷脂酰丝氨酸生物制造提供了高效、稳定且可回收的解决方案。

引言

磷脂酰丝氨酸是一种天然存在的负电荷甘油磷脂，也是细胞膜的重要结构成分。它在维持膜稳定性、促进细胞间通讯、调节受体功能以及介导营养物质和废物在膜上的运输等方面起着关键作用[1]。在中枢神经系统中，磷脂酰丝氨酸对于神经元的发育、功能维持以及可塑性尤为重要[2]、[3]、[4]、[5]。因此，磷脂酰丝氨酸已成为神经科学领域重要的研究对象。众多临床研究表明，外源性补充磷脂酰丝氨酸可显著提升认知功能，延缓记忆衰退的速度。鉴于这些显著益处，磷脂酰丝氨酸有望被用于开发具有提神作用的功能性食品以及具有神经保护作用的药物。

目前，磷脂酰丝氨酸的工业化生产仍面临诸多挑战，现有的主要生产方法包括物理提取、化学合成以及酶催化[6]。物理提取法以动物脑组织为原料，但受原料供应限制、可能存在疯牛病传播风险以及有机溶剂带来的严重污染等问题困扰。化学合成法则存在反应路径复杂、操作条件苛刻、副产物多以及最终产品纯度低等缺陷。相比之下，以大豆卵磷脂和L-丝氨酸为底物、由磷脂酶D催化的转磷脂酰化反应，作为一种绿色且高效的磷脂酰丝氨酸合成方法，受到了广泛关注[7]、[8]。磷脂酶D在温和条件下即可高效且特异性地催化该反应，且副产物生成极少，体现了其环境友好性[9]。然而，这种酶法应用的主要障碍在于成本高昂、稳定性差，且难以回收游离态的磷脂酶D，这些都严重限制了其在大规模工业中的应用。

固定化酶技术为解决上述问题提供了一种有效策略。常用的酶固定化载体包括无机多孔材料（如硅胶、分子筛）、合成聚合物（如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯）以及天然聚合物（如海藻酸钠、明胶）[10]。无机载体虽然生物相容性通常较差，且表面缺乏可修饰的基团，但却具有较高的机械强度、较大的比表面积以及优异的耐溶剂性。合成聚合物虽能实现结构可控且稳定性高，但其难降解性会带来环境问题。天然聚合物则具有出色的生物相容性且来源丰富，但其机械强度较低，往往会在使用过程中出现膨胀或降解现象[11]。壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，因其独特的理化性质而被视为极具潜力的固定化载体。作为一种天然阳离子多糖，壳聚糖成本低廉、来源广泛，同时还具备良好的生物相容性和可降解性[12]。尤其重要的是，其分子链上丰富的氨基（-NH₂）和羟基（-OH）可作为共价固定化酶的理想位点。通过戊二醛交联或碳二亚胺偶联等反应，这些官能团可与酶分子形成稳定的结合，从而实现高酶负载量与高效固定化，同时有效防止酶在操作过程中的泄漏[13]、[14]。在各种交联剂中，由于成本低廉且反应活性高，戊二醛被广泛应用，但它往往会导致过度或非特异性的交联，从而使酶失活。而来自栀子果的天然化合物没食子苷，则是一种更具生物相容性且作用更为温和的替代品。近期有研究系统比较了不同交联剂在壳聚糖基磁性载体上用于固定磷脂酶D的效果[15]，结果表明，在类似的壳聚糖-磁性载体上，没食子苷相比戊二醛能更好地保持酶的稳定性和活性[16]。此外，还有研究对酶固定化的最新进展进行了全面综述，涉及新型材料以及动态载体系统[17]。这些研究都为我们在本研究中选择没食子苷作为交联剂提供了依据。

要实现绿色且高效的磷脂酰丝氨酸酶催化合成，尤其是那些需要避免使用有毒溶剂的制药或食品应用而言，合适的反应体系至关重要。离子液体、深共晶溶剂、2-甲基四氢呋喃以及γ-戊内酯等新兴介质被视为极具前景的替代方案[18]、[19]、[20]、[21]。不过，由于对酶的稳定性要求较高且成本昂贵，这些介质在工业上的应用仍然受到限制。为克服传统有机溶剂的传质限制和效率瓶颈[22]，人们开发出了多种新型微反应体系，包括皮克灵乳液和混合微胶束。皮克灵乳液体系具有极高的催化效率，可在2小时内实现95.4%的磷脂酰丝氨酸产率[23]。混合微胶束体系则通过引入脱氧胆酸钠等表面活性剂，营造出稳定的微环境，从而提高底物的溶解度和酶的可及性。这种方法在药物递送领域已得到成功验证，混合微胶束纳米制剂显著提升了疏水性抗癌生物碱的生物利用度及其在肿瘤中的积累程度[24]，这也证明了其在酶催化合成应用中的潜力。

本研究基于壳聚糖载体，开发了一种经没食子苷交联的多层固定化系统用于固定磷脂酶D，该系统不仅实现了高酶负载量，还提升了酶的操作稳定性。通过结合物理吸附与共价交联两种方式，显著增强了PLD与载体之间的结合力。固定在载体上的Fe₃O₄@CS-Gnp-PLD展现出远优于游离PLD的催化性能，在双相体系和混合微胶束体系中的磷脂酰丝氨酸转化率分别提高了5.21倍和8.05倍。此外，这种固定化酶在混合微胶束体系中也表现出优异的重复使用性能，经过6次循环后仍保持80%的初始活性。即使在4℃下储存12天后，其活性也仍有72%，而游离酶则大多已失去活性。这些研究结果表明，Fe₃O₄@CS-Gnp-PLD具有出色的界面催化性能和工业应用价值，为绿色磷脂酰丝氨酸生物制造提供了高效、稳定且可回收的解决方案。

章节节选

材料

壳聚糖（CS，脱乙酰度≥95%）、磷脂酶D（PLD，来自链霉菌）、脱氧胆酸钠（SDC）、磷脂酰胆碱（PC）、L-丝氨酸（L-Ser）、没食子苷（Gnp）、FeCl₃·6H₂O以及FeSO₄·7H₂O均购自中国上海的阿拉丁生化科技有限公司。所有试剂均为分析级。

载体制备与PLD固定化

Fe₃O₄@CS纳米颗粒是通过共沉淀法制备的。在氮气保护下，将Fe²?和Fe³?离子（摩尔比为1:2）在80℃下发生反应，同时用氨水将反应体系的pH值调至10。

形态与结构表征

对固定化后的PLD的形态、结构以及磁响应进行了系统表征。扫描电子显微镜图像显示，未固定酶的Fe₃O₄@CS-Gnp载体（图1A）呈现出相对均匀的球形结构，表面较为粗糙，平均粒径约为100纳米。这种表面粗糙度为酶分子提供了大量的结合位点，从而显著提升了酶的负载能力。在PLD固定化后

结论

本研究成功制备了一种基于壳聚糖载体的磷脂酶D固定化系统，该系统在混合微胶束反应体系中展现了出色的催化性能和应用潜力。壳聚糖载体表面的活性基团为酶的高效固定提供了理想平台，而混合微胶束体系则通过营造稳定的微反应环境，显著提升了底物的溶解度和传质效率。与

CRediT作者贡献说明

张月：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，资金获取。刘志晨：方法学，实验研究，定量分析，数据整理。王彩云：方法学，实验研究，定量分析。吴俊健：软件应用。陈明：资金获取。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了以下项目的资助：辽宁省教育厅科学研究基金（编号：LJ212410152045、LJ222510152002）、辽宁省科技计划联合基金项目（编号：2025-MSLH-054）以及中国博士后科学基金会一般项目（编号：2024MD763929）。

Zhicen Liu|Caiyun Wang|Junjian Wu|Ming Chen|Yue Zhang

中国大连市116034，大连工业大学生物工程学院