DYRK1B：抗病毒天然免疫中RIG-I的新型正调控因子

《European Journal of Cell Biology》：DYRK1B: a novel positive regulator of RIG-I in antiviral innate immunity

　　

在针对感染的细胞内天然免疫传感器中，RIG-I样受体（RLR）作为胞质监视传感器来检测病毒RNA种类。然而，关于激酶以非催化依赖方式调节RIG-I的作用目前尚不明确。在本研究中，研究人员报道蛋白激酶DYRK1B是RIG-I介导的抗病毒天然免疫的新型正调控因子。DYRK1B的过表达显著增强了RNA病毒诱导的I型干扰素（IFN-I）的产生，而通过CRISPR介导的DYRK1B敲除则大幅削弱了这些抗病毒反应。机制研究表明，该调控作用不依赖于DYRK1B的催化激酶功能；相反，DYRK1B作为衔接蛋白将TRIM25与RIG-I连接，从而促进TRIM25介导的RIG-I的K₆₃连接的多泛素化，这是RIG-I功能激活所必需的关键修饰。总而言之，研究人员的发现揭示了DYRK1B通过增强RIG-I与TRIM25之间的物理结合来强化对抗RNA病毒的天然免疫，为抗病毒免疫调节的机制提供了更深入的理解。

研究背景与引言表明，在脊椎动物中，细胞通过表达多种模式识别受体（PRR），如Toll样受体（TLR）、RIG-I样受体（RLR）和NOD样受体（NLR）等来感知病原体相关分子模式（PAMP）。其中，RLR成员包括视黄酸诱导基因I（RIG-I）和黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5），负责在细胞质中检测来自RNA病毒的核酸并触发强烈的抗病毒转录反应。当RIG-I与配体结合后，会暴露其N末端的天冬氨酸残基富集激活结构域（CARD），进而与线粒体适配蛋白MAVS结合。这一相互作用组装了下游信号复合物，导致TANK结合激酶1（TBK1）和kB激酶ε（IKKε）激活、干扰素调节因子3（IRF3）核 translocation（核易位），随后诱导产生I型干扰素（IFN-I）和促炎细胞因子。RIG-I的激活阈值受到翻译后修饰的精确调控，特别是其CARD结构域的K₆₃连接的多泛素化是其发挥功能的关键修饰。该过程主要由E3泛素连接酶TRIM25驱动，促进RIG-I的多泛素化并增强其与MAVS的结合。尽管取得了实质性进展，但在病毒感染时控制TRIM25介导的RIG-I泛素化的上游调控网络仍不完全明确，特别是关于其他支架蛋白在此过程中的作用知之甚少。此外，虽然DYRK家族成员通常发挥激酶依赖性作用，且DYRK1B在肌生成、精子发生和神经发生等多种生物学过程中扮演重要角色并参与代谢紊乱和恶性肿瘤等疾病发生，但其是否以及如何参与转录因子IRF3介导的信号通路及RNA病毒感染后的抗病毒免疫防御仍是未解之谜。为了填补这些知识空白并探索未知的IFN-I诱导调控因子，研究人员开展了这项研究。结论表明，DYRK1B作为一种不依赖其典型激酶活性的分子支架，能够响应病毒感染并招募TRIM25至RIG-I，从而允许K₆₃连接的泛素链组装并放大下游级联反应。这一重要发现不仅扩展了DYRK家族在宿主防御中已知的功能谱，也为机体如何精确调控抗病毒免疫提供了新见解，论文发表在《European Journal of Cell Biology》。在研究方法上，研究人员首先通过挖掘在人类A549细胞中进行的全基因组CRISPR-Cas9功能筛选数据以筛选候选调控因子。随后，利用定量PCR、免疫印迹分析和荧光显微评估技术，分别在THP-1衍生巨噬细胞、HEK293T细胞、A549细胞、RAW264.7巨噬细胞和L929成纤维细胞开展了功能验证。研究采用了双荧光素酶报告基因检测、shRNA介导的基因敲低、CRISPR-Cas9介导的基因敲除等手段，并结合了免疫沉淀（Co-IP）、亚细胞组分分离、体内泛素化分析以及液相色谱-串联质谱法（IP-MS）等关键技术方法以解析蛋白互作网络和修饰机制。在研究结果部分，研究分为四个方面进行了详尽阐述。首先是RNA病毒触发的信号传导受DYRK1B正调控。研究人员发现，DYRK1B的表达在仙台病毒或水泡性口炎病毒感染后显著下降，且在H1N1流感病毒攻击后的支气管上皮中同样呈现降低趋势，呈现出与抗病毒免疫状态的功能联系。通过过表达实验发现，DYRK1B能以剂量依赖方式增强由病毒刺激的IFN-β、ISRE和NF-κB启动子活性，并上调IFNB1、ISG15等抗病毒靶基因转录，同时促进TBK1和IRF3的磷酸化。此外，通过构建丧失激酶活性的K140R突变体及三重突变体K140R/Y₂₇₁F/Y₂₇₃F进行验证，发现这些催化失活构建体仍保留了增强IFN-β启动子活性的全部能力，表明DYRK1B的抗病毒功能在机制上与其酶促活性解耦。其次是DYRK1B的耗竭会削弱病毒诱导的IRF3激活和干扰素转录。通过shRNA和CRISPR敲除技术，证实缺乏DYRK1B会显著降低SeV驱动的IFN-β和ISRE启动子活性，抑制抗病毒靶转录物诱导，并减弱TBK1和IRF3磷酸化。同时，稳定表达DYRK1B shRNA的细胞表现出VSV-GFP复制增强现象。在小鼠RAW264.7和L929细胞中敲低Dyrk1b同样损害了Irf3和Tbk1磷酸化，证明Dyrk1b是RLR信号级联反应中进化上保守且功能上不可或缺的激活因子。第三部分是DYRK1B通过互作RIG-I促进抗病毒信号传导。Co-IP实验表明，DYRK1B与RIG-I外源共表达时存在相互作用，且主要定位于细胞质中。尽管DYRK1B过表达未改变RIG-I的蛋白稳定性，但它显著增强了RIG-I与MAVS之间的物理结合，而在DYRK1B缺失的细胞中两者的组装大大减少。进一步的修饰分析揭示，DYRK1B过表达增加了RIG-I的总多泛素化水平，尤其是特异性促进了K₆₃连接的多泛素化修饰，对K₄₈或K₆₃R连接的泛素链影响极小，并且在DYRK1B缺陷的细胞中，由SeV感染触发的RIG-I内源性K₆₃多泛素化显著降低，充分证明其驱动修饰的核心作用。最后部分探讨了DYRK1B通过招募TRIM25促进K₆₃连接的RIG-I多泛素化。研究人员通过IP-MS分析鉴定出TRIM25是与DYRK1B结合的关键候选互作蛋白。在静息条件下，DYRK1B、TRIM25和RIG-I之间的复合物形成极少，但在SeV感染后该复合物显著增加，表明DYRK1B是一种受感染调控的支架。机制上，DYRK1B过表达增强了TRIM25与RIG-I的结合，而基因敲除则导致该结合减少。在功能缺失背景下，DYRK1B的缺陷严重损害了TRIM25驱动的IFN-β启动子诱导，并在TRIM25敲低的细胞中，DYRK1B不再能增强RIG-I的多泛素化。研究结论总结指出，这项工作揭示了DYRK1B在对抗RNA病毒的天然免疫中的一种新功能，其作为不依赖激酶活性的RIG-I泛素化激活因子，通过在病毒感染时支架化招募E3连接酶TRIM25至RIG-I，促进其发生关键的K₆₃连接多泛素化修饰，从而降低RIG-I的激活阈值以引发强健的抗病毒基因表达。结合DYRK家族另一成员DYRK4能够稳定转录因子IRF3的平行发现，此研究得出结论：不同的DYRK家族成员已经进化出针对抗病毒信号级联不同节点的靶向能力，采用机制截然不同的策略来增强宿主防御。