《European Journal of Medicinal Chemistry》：Discovery of 2, 4-disubstituted Pyrimidine Derivatives as Selective HIPK2 Inhibitors for Potential Treatment of Chronic Kidney Disease
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•已发现具有亚微摩尔级活性的选择性HIPK2抑制剂。•AF-1和AF-2能够抑制TGF-β/Smad3、p53以及NF-κB信号通路。•AF-1和AF-2可减轻慢性肾病模型中的肾损伤与纤维化。•AF-1和AF-2具备良好的药物特性。引言慢性肾病已成为全球重大的公共卫生问题，全球有
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已发现具有亚微摩尔级活性的选择性HIPK2抑制剂。
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AF-1和AF-2能够抑制TGF-β/Smad3、p53以及NF-κB信号通路。
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AF-1和AF-2可减轻慢性肾病模型中的肾损伤与纤维化。
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AF-1和AF-2具备良好的药物特性。
引言
慢性肾病已成为全球重大的公共卫生问题，全球有超过8.5亿人受其影响，其中约400万患者需要接受肾脏替代治疗[1]。预计到2050年，慢性肾病将成为全球第五大死亡原因[2]。慢性炎症伴随的肾小管间质纤维化是慢性肾病的核心病理特征，最终会导致肾功能不可逆地丧失[3]、[4]。然而目前尚无可直接针对肾纤维化的获批疗法，现有治疗手段主要只能延缓疾病进展[5]。
在临床中，钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂（如达格列净）和非甾体类盐皮质激素受体拮抗剂（如芬立酮）被广泛用于延缓肾功能下降。但这些药物的抗纤维化作用较为有限，且无法完全阻止疾病向终末期肾病发展[6]。因此，寻找与肾纤维化相关的新型分子靶点对于开发更有效的治疗策略至关重要。
同源结构域相互作用蛋白激酶2（HIPK2）近期被认定为治疗慢性肾病的潜在靶点[7]。在慢性肾病患者的肾组织以及多种肾纤维化实验模型中，HIPK2的表达水平均有所升高。基因敲除HIPK2可显著减轻肾小管间质纤维化，而其过表达则会加剧肾损伤[8]。从机制上看，HIPK2可调控多条促纤维化及促炎信号通路，包括TGF-β/Smad3、Wnt/β-catenin、Notch、p53以及NF-κB信号通路，这进一步证明了它在慢性肾病进展中的作用[9]。HIPK家族包含四种亚型（HIPK1–4），其中HIPK1、HIPK2和HIPK3在激酶结构域上具有高度同源性[10]。HIPK1参与细胞的增殖、分化以及凋亡过程[11]，而HIPK3则在葡萄糖代谢和胰腺β细胞功能中起着关键作用[12]、[13]。正因如此，非选择性的HIPK2抑制剂可能会带来不必要的脱靶效应，这也凸显了在药物设计中实现亚型选择性的重要性。
为此，人们投入了大量精力研发HIPK2抑制剂。目前已报道的HIPK2抑制剂可分为三类：表达抑制剂、蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂以及激酶抑制剂。磷酸尼可沙胺[14]（1）（图1）是一种HIPK2蛋白表达抑制剂，它通过干扰Smad3与HIPK2启动子的结合来抑制HIPK2的表达，从而减轻TGF-β引发的肾纤维化。BT173[15]（2）则是一种典型的蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂，它能阻断HIPK2与TGF-β/Smad3之间的相互作用，在多种动物模型中展现出显著的抗纤维化活性。其衍生物RLA-23174[16]更是已进入临床评估阶段。在激酶抑制剂方面，也有不少小分子被报道出来。早期的研究用化合物如TBID[17]（3）仅具有中等程度的HIPK2抑制活性。通过CK2激酶分析筛选出的12b（4）和5b（5）则表现出很强的HIPK2抑制活性（IC50 < 3 nM）[18]、[19]。其他化合物，包括多靶点抑制剂STO-609[20]（6）、TAE-226[21]（7）和CTx-0294857[22]（8），以及基于结构设计的配体MU135[23]（9）和CX-4945[24]（10），也都表现出不同程度的HIPK2激酶抑制效果。我们的团队还研发出了CHR-6494[25]（11）、c4[26]（12）、Hit 2c[27]（13）、15q[28]（14）和XRF-1021[29]（15），这些化合物都具有抗纤维化活性。
基于我们之前的研究结果，化合物15q对HIPK2亚型具有较好的选择性。为了进一步提升其活性与选择性，我们选择15q作为先导化合物。参考高效激酶抑制剂5b的已知结合模式，我们采用了药效团杂化策略来指导该化合物的结构设计。如图2所示，该分子被分为三个区域（A区、B区、C区）以便进行系统优化：在A区，我们将苯并咪唑结构替换为从化合物5b衍生而来的氰基取代吡唑并[3,4-d]嘧啶核心，以此引入其有益的结构特征；在B区，我们分别研究了嘧啶环的翻转态与未翻转态对其整体结合模式的影响；在C区，则对暴露在溶剂中的侧链进行了优化，以改善分子的理化性质。所有最终得到的化合物都会通过激酶检测以及NRK-49F细胞的存活率检测进行筛选。化合物A6和B11在体外实验中对HIPK2表现出极高的选择性，同时还能显著抑制促纤维化标志物（如FN和I型胶原蛋白）的表达。此外，在0.2%腺嘌呤饮食诱导的慢性肾病模型中，A6和B11也展现出了明显的抗纤维化效果。这些研究结果表明，提高HIPK2亚型选择性有助于提升抗肾纤维化活性，而A6和B11有望成为进一步开发治疗慢性肾病药物的候选分子。
章节节选
化学结构
所有目标化合物都是按照方案1和方案2中所描述的路线合成的。对于A系列化合物（方案1），首先将化合物1与丙二酸二乙酯发生反应，随后经过环化反应得到中间体2。再用氯磷酸处理中间体2，即可得到中间体3。接着对中间体3进行环丙胺取代反应，就能得到中间体4。与此同时，其他各种取代胺也经过了类似的亲核取代反应。
HIPK2抑制活性评估、对NRK-49F细胞的抗增殖作用研究以及构效关系分析
我们合成的化合物（A1-A9和B1-B16）首先接受了初步的体外生物学评估。我们使用ADP-Glo?激酶检测方法，在10 μM浓度下测定这些化合物对HIPK2激酶的抑制活性，同时通过CCK-8检测方法评估它们对NRK-49F细胞的抗增殖作用。作为阳性对照，我们使用了先导化合物15q以及广谱激酶抑制剂星形孢菌素。相关检测结果汇总在表1和表2中。此外，我们还对这些化合物进行了结构修饰研究。
结论
综上所述，我们以先导化合物15q和氰基取代吡唑并[3,4-d]嘧啶骨架为基础，通过药效团杂化策略，成功开发出一系列2,4-二取代嘧啶衍生物作为HIPK2抑制剂。经过优化后，我们得到了AF-1和AF-2这两种化合物，它们不仅具有亚微摩尔级的HIPK2抑制活性，而且相较于结构相近的HIPK1和HIPK3亚型，也展现了更高的选择性。
在TGF-β1刺激的NRK-49F细胞中，AF-1和AF-2能够发挥抑制作用。
常用化学实验方法
除非另有说明，所有起始原料和试剂均从商业供应商（Sigma-Aldrich、Aladdin、Energy Chemical以及上海碧德）处购买，使用时无需进一步纯化。反应进程通过薄层色谱法在预涂有GF/UV 254硅胶板的载体上，在紫外光下进行监测。产物则通过200-300目硅胶柱色谱法进行纯化。最终化合物的化学纯度（高于95%）则是通过HPLC检测仪结合Welchrom检测系统来确认的。
作者贡献说明
卓晨：实验研究、资金申请。徐杰：实验研究。冯春宇：论文撰写与修改、项目监督、实验研究、数据分析、数据整理。欧阳汉毅：实验研究、数据分析、数据整理、概念构思。姚梦梦：实验研究。吴岩：数据可视化、软件应用。胡欣兰：论文撰写与修改、初稿撰写、数据可视化、实验研究、数据分析、数据整理、概念构思。李千斌：项目监督、实验研究。
伦理声明
本项研究是按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告规范）指南开展的。该研究已获得中南大学动物福利与伦理委员会的批准（批准编号：XY20240229013）。
利益冲突声明
所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
利益冲突声明
所有作者均声明，在本研究中不存在任何已知的财务利益冲突。
致谢
本项工作得到了中国国家自然科学基金的资助（项目编号：81773640）。
Xinlan Hu|Hanyi Ouyang|Chunyu Feng|Yan Wu|Mengmeng Yao|Jie Xu|Zhuo Chen|Qianbin Li
