《Experimental Eye Research》：Chemerin and NPC2 produced from iPSC-derived Müller glial cells promote retinal ganglion cell regeneration
编辑推荐：
•早期的穆勒胶质细胞是由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜类器官生成的。•通过对类器官培养液进行蛋白质组分析，发现了化学素和NPC2这两种物质。•研究表明，化学素和NPC2能够抑制大鼠视网膜神经节细胞的死亡，并促进其轴突的生长。•这两种物质在不同年龄的大鼠视网膜以及早期穆勒胶质细胞中
- •
早期的穆勒胶质细胞是由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜类器官生成的。
- •
通过对类器官培养液进行蛋白质组分析，发现了化学素和NPC2这两种物质。
- •
研究表明，化学素和NPC2能够抑制大鼠视网膜神经节细胞的死亡，并促进其轴突的生长。
- •
这两种物质在不同年龄的大鼠视网膜以及早期穆勒胶质细胞中均有表达。
引言
视网膜神经节细胞位于视网膜内侧，通过轴突将视觉信息从视网膜传递到大脑，起着至关重要的作用。许多视神经疾病，如青光眼、前部缺血性视神经病变、视神经炎、创伤性视神经病变以及莱伯遗传性视神经病变，都会导致视网膜神经节细胞逐渐丧失，最终引发全视网膜范围的神经节细胞死亡和不可逆的视力丧失（Biousse和Newman，2016；Buonfiglio等人，2023）。目前，人们正在探索多种治疗手段，包括神经保护、基因治疗以及细胞替代疗法，以应对视网膜神经节细胞的丢失问题。其中，细胞替代疗法具有巨大潜力，因为它可以通过将健康的供体细胞植入患病的机体环境中来恢复视力。不过，将外源性的原始视网膜神经节细胞或干细胞衍生的视网膜神经节细胞进行体内移植的技术仍处于起步阶段。这一领域面临着诸多挑战，比如提高移植细胞的存活率、重建完善的视网膜及大脑神经回路等（Soucy等人，2023；Zhang等人，2021）。除了这些技术难题之外，还需要对移植结果进行准确解读。在老鼠的光感受器移植实验中观察到了宿主细胞与供体细胞之间的细胞质交换现象，因此在将细胞移植到部分退化的视网膜时，必须考虑供体细胞与宿主细胞之间的物质传递情况（Santos-Ferreira等人，2016）。而能够促进轴突再生和延伸的辅助因子或许可以成为克服这些障碍的途径。
穆勒胶质细胞是脊椎动物视网膜中的主要胶质细胞，它们与视网膜神经元一同由视网膜前体细胞在发育早期形成。这类细胞遍布整个视网膜的宽度，为几乎所有的视网膜神经元提供结构支撑（Bringmann等人，2006；Eastlake等人，2020）。由于这种分布特征，穆勒胶质细胞在视网膜各处发挥着重要的生理功能（Bringmann等人，2006；Eastlake等人，2020）。它们还为视网膜神经元提供营养支持、代谢支持以及抗氧化保护，同时通过神经递质回收来维持神经元活性，这些作用都具有神经保护作用（Reichenbach和Bringmann，2013）。在穆勒胶质细胞上培养视网膜神经节细胞有助于维持其存活并促进神经突的生长，这表明穆勒胶质细胞会分泌具有神经保护作用的因子（NTFs）（de Melo Reis等人，2008；Ruzafa和Vecino，2015）。在不同环境下，穆勒胶质细胞会分泌不同的NTFs：在遇到谷氨酸时，它们会释放脑源性神经营养因子、神经生长因子、胶质细胞系源性神经营养因子、神经营养素3和4；而在受到BDNF或GDNF的作用时，则会释放碱性成纤维细胞生长因子（Eastlake等人，2020）。在青光眼或视神经损伤的动物模型中，这些NTFs都具有保护视网膜神经节细胞的作用（Boia等人，2020；Peinado-Ramon等人，1996；Xie等人，2015）。此外，穆勒胶质细胞分泌的色素上皮来源因子或血管内皮生长因子也对缺血状态的视网膜神经节细胞具有保护作用（Unterlauft等人，2012；Zwanzig等人，2021）。糖尿病视网膜病变、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞以及青光眼等疾病都会导致视网膜缺血以及随后的视网膜神经节细胞死亡。正是由于穆勒胶质细胞具备这些重要特性，人们才对其在疾病治疗中的应用产生了浓厚兴趣（Eastlake等人，2020）。除了对病理状态的响应之外，穆勒胶质细胞还会通过分泌营养因子来促进视网膜细胞的发育（Tworig和Feller，2021）。
在本研究中，我们发现了穆勒胶质细胞分泌的、有助于视网膜神经节细胞发育和存活的新分子。利用从人类诱导多能干细胞生成的穆勒胶质细胞，我们发现其中有两种蛋白质——化学素和NPC细胞内胆固醇转运蛋白2——会从人类穆勒胶质细胞中分泌出来，这两种蛋白质在视网膜神经节细胞的发育过程以及移植后都能促进其轴突的生长。
章节要点
实验动物
实验用的大鼠来自日本SLC公司，包括7天大的雄性大鼠、8周大的雄性大鼠以及一只怀孕的雌性大鼠。为了减少实验条件带来的差异，8周大的大鼠仅使用了雄性，而由于技术限制，7天大的大鼠则没有区分性别。所有实验动物都按照ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的准则以及NIH关于动物护理和使用的指导原则进行饲养管理。
人类诱导多能干细胞衍生穆勒胶质细胞的生成
此前，我们已经利用人类诱导多能干细胞成功培育出了含有具有功能轴突的视网膜神经节细胞的视网膜类器官（Tanaka等人，2015）。这类类器官具有一个细胞团，即OV结构，而视网膜神经节细胞的轴突则从OV结构的边缘向外辐射生长。在轴突生长的同时，我们还在轴突下方发现了非神经元的黏附细胞。由于这些细胞对波形蛋白免疫染色呈阳性，因此我们认为它们就是早期穆勒胶质细胞。（见图1a）这些细胞对谷氨酰胺合成酶也呈阳性反应。
早期穆勒胶质细胞的特征
本研究中所分析的、由人类诱导多能干细胞生成的D31、D37和D48型早期穆勒胶质细胞表达了多种穆勒胶质细胞标志基因。它们的特征与pMGC细胞以及Couturier等人研究的成熟早期穆勒胶质细胞相似。在我们的早期穆勒胶质细胞中，随着培养时间的增加，穆勒胶质细胞标志物CD44的表达水平上升，而SLC1A3的表达水平则下降。CD44主要在外周视网膜的穆勒胶质细胞中表达，而SLC1A3则主要在中枢视网膜的穆勒胶质细胞中表达（Menon等人，2019；Too等人，2017）。不同类型的穆勒胶质细胞具有不同的功能特性。
结论
我们在相对较短的时间内，就利用人类诱导多能干细胞衍生的视网膜类器官成功培育出了早期穆勒胶质细胞。这类细胞表达的BDNF、NGF和NT-4基因的水平高于pMGC细胞。早期穆勒胶质细胞会分泌化学素和NPC2这两种蛋白质，而这些蛋白质不仅具有保护视网膜神经节细胞的作用，还能促进其轴突的生长，这说明这两种蛋白质有望在未来视网膜神经节细胞的保护及再生技术中发挥重要作用。
作者贡献说明
小林桃子：负责撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验开展、正式数据分析以及数据整理工作。平田正之：负责数据可视化、方法设计、实验开展以及正式数据分析工作。东马纪之：负责论文审阅与编辑、项目监督、资金筹集以及研究构思工作。田中拓：负责实验开展以及正式数据分析工作。岸本弥生：负责论文审阅与编辑、项目管理工作、方法设计以及研究构思工作。深江千穗：负责论文审阅与编辑、项目监督工作。
未引用参考文献
Lynch和Abràmoff，2017；Peinado-Ramón等人，1996。
作者利益冲突声明
本研究得到了Senju Pharmaceutical Co., Ltd.、日本学术振兴会KAKENHI项目（资助编号17K19738）、日本医疗研究开发机构AMED项目（资助编号17ek0109217h0001）以及美国国家儿童健康与发展中心提供的资助（编号28-2）的支持。
资金支持
本研究得到了Senju Pharmaceutical Co., Ltd.、日本学术振兴会KAKENHI项目（资助编号17K19738）、AMED项目（资助编号17ek0109217h0001）以及美国国家儿童健康与发展中心的资助（编号28-2）的支持。
利益冲突声明
? 作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益/个人关系：深江千穗持有针对Senju Pharmaceutical Co., Ltd.的专利申请；东马纪之持有针对美国国家儿童健康与发展中心的专利申请；岸本弥生持有针对Senju Pharmaceutical Co., Ltd.的专利申请；小林桃子持有针对Senju Pharmaceutical Co., Ltd.的专利申请。如果还有其他作者，他们声明自己不存在此类利益冲突。
Momoko Kobayashi|Taku Tanaka|Yayoi Kishimoto|Masayuki Hirata|Noriyuki Azuma|Chiho Fukiage
