《Fish & Shellfish Immunology》：MDA5 associates with MAVS and its splicing variant in the antiviral response of large yellow croaker
Larimichthys crocea
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•Lc-MDA5可被病毒和细菌的PAMPs诱导产生•Lc-MDA5能与典型的MAVS（Lc-MAVS_tv1）及其剪接变体（Lc-MAVS_tv2）发生相互作用•Lc-MDA5在IRF3/7介导的I型干扰素信号传导及抗病毒反应中与Lc-MAVS_tv1和Lc-MAVS_tv2相互
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Lc-MDA5可被病毒和细菌的PAMPs诱导产生
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Lc-MDA5能与典型的MAVS（Lc-MAVS_tv1）及其剪接变体（Lc-MAVS_tv2）发生相互作用
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Lc-MDA5在IRF3/7介导的I型干扰素信号传导及抗病毒反应中与Lc-MAVS_tv1和Lc-MAVS_tv2相互关联
引言
模式识别受体是先天免疫系统的主要传感器，在抵御病原体侵袭的宿主防御中起着不可或缺的作用[1]。当检测到各种病原体相关分子模式，如蛋白质、脂质、多糖和核酸时，PRRs会迅速激活免疫反应[2]。这类传感器主要包括Toll样受体（TLRs）[3]、[4]、C型凝集素受体（CLRs）[5]、NOD样受体（NLRs）[6]以及视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）[7]。
RLRs作为关键的细胞质哨兵，能在病毒入侵的早期阶段将其识别出来[8]、[9]。这一家族包含三种已明确界定的成员：RIG-I、黑色素瘤分化相关基因5（MDA5）以及遗传学与生理学实验室2基因（LGP2）[10]、[11]。RIG-I和MDA5具有保守的结构域，包括负责识别配体的C端结构域（CTD）、调控ATP水解和RNA结合的中央DEXD/H RNA螺旋酶结构域，以及有助于信号转导的两个N端半胱天冬酶激活和招募结构域（CARDs）[12]。LGP2缺乏CARDs，长期以来被认为无法单独启动信号传导，但后来研究发现它在低表达水平下也能激活干扰素信号，并能协助RIG-I和MDA5发挥抗病毒作用[13]、[14]。
MDA5也被称为IFIH1，是检测长双链RNA的主要传感器。在识别到配体后，MDA5会改变构象，使其CARDs暴露出来，从而与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）发生相互作用[15]。这种结合会进一步激活TANK结合激酶1（TBK1），进而引发下游I型干扰素的产生及先天免疫防御反应[16]。
MAVS也被称为IPS-1、VISA或Cardif，是RLR介导的抗病毒信号通路中不可或缺的适配分子。它包含一个与RIG-I和MDA5结合的N端CARD结构域、一个参与下游信号传导的富含脯氨酸的中间区域（PRR），以及一个将蛋白质定位在线粒体外膜的C端跨膜结构域（TM）。这种膜结合特性有助于招募并激活下游的信号分子。
近期，人们在多种真骨鱼类中克隆出了MDA5的同源基因，并对其功能进行了研究，这些鱼类包括草鱼（Ctenopharyngodon idella）[17]、[18]、[19]、日本比目鱼（Paralichthys olivaceus）[21]、虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）[20]、斑马鱼（Danio rerio）[22]、橙点石斑鱼（Epinephelus coioides）[23]、黑鲤（Mylopharyngodon piceus）[24]、 Mandarin鱼（Siniperca chuatsi）[25]、米鱼（Miichthys miiuy）[26]以及北方蛇头鱼（Channa argus）[27]。功能研究表明，鱼类中的MDA5可通过CARD与CARD之间的相互作用与MAVS结合，从而激活下游的抗病毒信号传导[18]、[22]。值得注意的是，在真骨鱼类中，MAVS基因会发生可变剪接，产生功能各异的变异体。在斑马鱼中，两种不同的MAVS亚型——MAVS_tv1和MAVS_tv2——对干扰素的生成起着不同的作用[28]。我们之前的研究也在大黄鱼中发现了两种MAVS剪接变体，即Lc-MAVS_tv1和Lc-MAVS_tv2，它们具有不同的亚细胞定位，对NF-κB和IRF3的激活也具有不同的调控作用[29]。然而，Lc-MDA5是否真的与这些MAVS剪接变体存在功能上的关联，尤其是与缺乏TM结构的Lc-MAVS_tv2之间是否存在关联，目前还不清楚。此外，尽管缺乏C端跨膜结构域，Lc-MAVS_tv2是否仍能参与Lc-MDA5介导的抗病毒信号传导，这也尚无定论。因此，阐明大黄鱼中的MDA5与MAVS剪接变体之间的相互作用及功能关系，有望为了解真骨鱼类中RLR-MAVS信号通路的多样性提供新的见解。
大黄鱼是一种生活在中层水域、属于暖温带沿海群居洄游性鱼类，主要分布于中国的沿海海域和东海，具有较高的经济价值。本研究分离出了大黄鱼的MDA5基因，并检测了健康个体以及受到不同PAMPs刺激的个体多个组织/器官中该基因转录本的丰度。更重要的是，本研究阐明了大黄鱼中MDA5与MAVS（包括其剪接变体）之间的相互作用机制。同时，研究还明确了这种相互作用对IRF3、IRF7和IFNd基因启动子激活的影响，以及其对下游免疫相关基因表达和病毒复制的调控作用。这些发现为进一步研究MDA5、MAVS及其剪接变体之间的相互作用提供了新的思路。
章节摘要
鱼类与细胞
用于本研究的大黄鱼，体长为18.0 ± 1.5厘米，体重为60.0 ± 15.0克，来自中国宁德的宁德福发渔业有限公司。在实验开始前，这些鱼被置于温度为24–26°C的循环海水中饲养了两周以适应实验环境。人类胚胎肾293T细胞（HEK 293T）[30]、[31]、[32]、鲤鱼乳头状上皮瘤细胞（EPC）[33]、[34]以及大黄鱼肌肉细胞（LYCMS）[35]、[36]均按照常规方法进行培养。
大黄鱼MDA5基因的分子克隆与序列分析
研究团队成功分离出了完整的MDA5开放阅读框，并将其命名为Lc-MDA5（GenBank编号为PZ497921），该基因全长为2,976 bp，可编码991个氨基酸的多肽链。通过NCBI保守结构域数据库的分析发现，Lc-MDA5的N端含有两个串联的CARD结构域（位于5-94氨基酸位点和110-191氨基酸位点），还有一个DEXDc结构域（位于293-476氨基酸位点）、一个HELICc结构域（位于724-783氨基酸位点），而在C端则有一个RD结构域（位于860-977氨基酸位点）（见补充图1）。
随后，研究团队对Lc-MDA5蛋白的序列进行了分析。
讨论
作为先天免疫系统的基础传感器，PRRs是抵御病原体入侵的第一道防线，能够快速有效地触发防御反应。在RLR家族中，MDA5在检测病毒长双链RNA及启动抗病毒信号传导过程中发挥着至关重要的作用[46]。本研究成功分离出了大黄鱼中的MDA5同源基因，并对其功能进行了研究，将该基因命名为Lc-MDA5。研究结果表明，Lc-MDA5在抗病毒反应中起着关键的中介作用。
作者致谢
李颖：论文初稿撰写、审阅与修改、数据整理、资金申请。
张一凡：研究构思、实验开展、数据整理、论文初稿撰写。
陈晓明：论文审阅与修改。
马强：论文审阅与修改。
张娇楠：论文审阅与修改。
黄小梅：论文审阅与修改。
李静轩：实验开展。
朱玉轩：实验开展。
郭团宇：论文审阅与修改。
邹鹏飞：论文初稿撰写、审阅与修改、项目指导与监督。
致谢
在此，我们要感谢实验室的所有成员在论文撰写过程中给予的宝贵意见和帮助。本项研究得到了福建省教育厅青年骨干教师教育科研项目（科技类）的资助（项目编号JZ250084），以及中国国家自然科学基金（项目编号31772878）、中国厦门市自然科学基金（项目编号3502Z202573057）等项目的支持。
李颖|张一凡|陈晓明|马强|张娇楠|黄小梅|李静轩|朱玉轩|郭团宇|邹鹏飞
