《Food and Chemical Toxicology》：Autophagy suppression is associated with enhanced preneoplastic hepatocellular lesions in rats fed a lard-containing high-fat diet
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代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction–associated steatotic liver disease, MASLD）是肝细胞癌的主要危险因素，然而自噬在早期肝癌发生中的作用仍不清楚。研究人员在含猪油高脂饮食诱导的脂肪肝大
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction–associated steatotic liver disease, MASLD）是肝细胞癌的主要危险因素，然而自噬在早期肝癌发生中的作用仍不清楚。研究人员在含猪油高脂饮食诱导的脂肪肝大鼠模型中，评估了联合或不联合部分肝切除术（partial hepatectomy, PH）情况下的自噬动态变化。高脂饮食联合部分肝切除术显著增加了血浆丙氨酸氨基转移酶水平、肝脏脂肪变性及肝癌前病变的发展。为分析这些癌前病变，研究人员利用LC3、p62和LAMP2的表达水平进行了k均值聚类分析。基于病变面积和LC3比率的初始聚类识别出五个簇，从中选取了面积较大或LC3表达较高的三个簇，并根据LC3和p62水平进一步将其划分为两个簇。自噬抑制簇（高p62和低LC3表达）的癌前病变面积显著大于自噬诱导簇（低p62和高LC3表达）。这些发现进一步得到LC3与LAMP2聚类分析以及自噬-溶酶体-内体、脂质代谢、氧化应激和内质网应激相关基因表达的相关性支持。尽管未直接在癌前病变中测量功能性自噬通量，但静态免疫组织化学标志物的聚类分析提示，自噬抑制与早期脂肪变性相关肝癌发生密切相关。
**论文解读：自噬抑制在含猪油高脂饮食联合部分肝切除大鼠模型早期肝癌发生中的作用**
**一、研究背景与目的**
代谢功能障碍相关脂肪性肝病（metabolic dysfunction–associated steatotic liver disease, MASLD）是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）的重要危险因素。MASLD的发病机制涉及多因素，包括饮食习惯、环境因素和遗传因素，其中高饱和脂肪酸（saturated fatty acids, SFAs）饮食是主要风险因素之一。自噬作为细胞维持稳态的保护机制，通过降解受损细胞器和过量脂滴来保护肝细胞免受脂毒性损伤，从而抑制MASLD进展。然而，自噬在早期肝癌发生中的具体作用仍不明确。本研究基于两阶段致癌模型，采用50 kcal%猪油高脂饮食（high-fat diet, HFD）联合部分肝切除术（partial hepatectomy, PH），旨在探讨自噬状态与大鼠肝脏癌前病变发展的关联。此前研究采用45 kcal%猪油HFD虽能诱导癌前病变，但实验组间差异不显著，模型可重复性欠佳。本研究通过免疫组织化学标志物（LC3、p62和LAMP2）的k均值聚类分析，试图在单个显微病变水平预测自噬通量状态，以阐明自噬抑制在脂肪变性相关早期肝癌发生中的作用。
**二、主要技术方法**
本研究使用5周龄雄性F344大鼠（购自The Jackson Laboratory Japan），腹腔注射二乙基亚硝胺（N-diethylnitrosamine, DEN, 200 mg/kg体重）启动致癌，随后分为四组：基础饮食组（BD）、基础饮食+PH组（BD+PH）、高脂饮食组（HFD）、高脂饮食+PH组（HFD+PH）。PH于处理开始后第3周实施。第12周末处死动物，采集血液和肝脏样本。主要技术包括：血液生化分析（JCA-BM6050 BioMajesty?自动分析仪）；组织病理学评估（H&E染色、苏丹黑B染色，依据NAFLD活动度评分（NAS）评分）；免疫组织化学检测（GST-P、LC3、p62、LAMP2，采用VECTASTAIN? Elite ABC试剂盒）；基于免疫组织化学标志物的k均值聚类分析（两轮聚类：第一轮基于GST-P阳性面积与LC3表达，第二轮基于LC3与p62、LC3与LAMP2、p62与LAMP2组合）；实时逆转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）检测自噬-溶酶体-内体、脂质代谢、凋亡、炎症、内质网应激和氧化应激相关基因表达；Spearman秩相关分析评估基因表达相关性。
**三、研究结果**
**3.1 HFD喂养联合PH导致肥胖、高胆固醇血症和脂肪变性**
HFD喂养组虽未表现出体重增加，但腹腔内脂肪绝对重量和相对重量均显著增加，提示腹腔内脂肪重量比体重更能敏感反映肥胖状态。血液生化检测显示，HFD+PH组总胆固醇（T-CHO）和酯化胆固醇（E-CHO）水平显著高于BD组，而甘油三酯（TG）水平显著降低。天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平在HFD+PH组最高，表明HFD与PH联合加剧了高胆固醇血症和肝损伤。组织病理学检查证实HFD组肝脏脂肪变性、气球样变及苏丹黑B阳性面积显著增加，PH进一步加重了这些改变，炎症灶评分未受HFD影响。
**3.2 HFD喂养或PH处理可诱导肝部癌前病变**
GST-P阳性癌前病变定量分析显示，HFD组每单位面积GST-P阳性灶数量显著高于BD组，HFD+PH组进一步显著增加，且HFD+PH组GST-P阳性灶总面积也显著高于BD组和HFD组，证实HFD联合PH协同促进早期肝癌发生。
**3.3 自噬抑制与HFD喂养联合PH处理诱导的癌前病变相关**
利用k均值聚类分析GST-P阳性病灶内LC3、p62和LAMP2表达特征。第一轮聚类（基于病变面积与LC3表达）将病灶分为5个簇，HFD+PH组中C1和C3频率显著升高，C1、C4和C5簇的病变面积显著大于C3，提示HFD+PH组癌前病变总体增加主要由C1、C4和C5簇扩展驱动。第二轮聚类在PH组中（以BD+PH为对照）分析LC3与p62、LC3与LAMP2、p62与LAMP2组合。LC3与p62聚类分析中，低LC3高p62亚簇C2（提示早期自噬抑制）在HFD+PH组中比例显著高于BD+PH组，且该亚簇病变面积显著大于亚簇C1。LC3与LAMP2聚类分析中，低LC3伴低至中度LAMP2的亚簇C2在HFD+PH组呈增加趋势，且病变面积显著大于亚簇C1。p62与LAMP2聚类分析未发现各亚簇间病变面积显著差异。这些结果表明，HFD+PH组内扩增的癌前病变以自噬初始抑制为特征，且该表型特异性归因于HFD介导的细胞应激而非PH手术本身。
**3.4 HFD喂养联合PH处理大鼠肝脏样本基因表达**
基因表达分析显示，HFD+PH组抗氧化酶基因Gpx1和Sod1表达显著上调且呈正相关，Abca1（胆固醇转运蛋白）基因在HFD喂养组中上调。自噬相关基因方面，Atg14（促进自噬体与溶酶体融合）在HFD+PH组显著上调，Stx17（SNARE蛋白）在BD+PH组显著下调。相关性分析显示三个基因共表达模块：M1（Stx17、Atg14、Snap29）、M2（Atg5、Beclin、Lamp2、Lamp1、Lc3）、M3（Vamp8、P62、Atg7）。Atg14与Stx17、Snap29正相关，并与抗氧化酶基因Sod1、Gpx1及凋亡相关基因Bax正相关，Stx17还与脂质代谢基因Srebf2和Fasn正相关。
**四、讨论与结论**
本研究所采用的50 kcal%猪油HFD仅诱导脂肪变性和高胆固醇血症，未出现肥胖、高TG或糖尿病，提示该模型反映的是MASLD早期或初步阶段而非晚期全身性代谢疾病。PH手术本身可诱导一过性脂肪肝，HFD与PH联合进一步加重脂肪变性，伴随氧化应激标志物（Gpx1和Sod1）的显著上调。HFD+PH组血浆T-CHO升高而TG降低，可能与Abca1上调促进胆固醇外排和肝细胞损伤导致VLDL合成或分泌受损有关。
通过免疫组织化学k均值聚类分析，本研究在单个显微病变水平揭示了HFD+PH组中扩增的癌前病变呈现低LC3、低LAMP2和高p62的表型特征，提示自噬的初始抑制与癌前病变加速生长密切相关。Atg14基因上调及其与P62、Snap29、Stx17的正相关可能反映了对下游自噬降解阻断的代偿性转录反应。猪油中富含的棕榈酸可能通过灭活AMPK、持续激活mTOR、降低LC3-I/LC3-II比值来抑制功能性自噬通量。基因共表达网络进一步表明，自噬-溶酶体-内体系统与脂质代谢、氧化应激和内质网应激通路存在高度协调的转录适应。
本研究结论：含猪油HFD喂养联合PH加速了脂肪变性、高胆固醇血症和肝部癌前病变的发展。通过免疫组织化学k均值聚类方法预测局部自噬通量改变，揭示以LC3、p62和LAMP2协同失调为特征的自噬初始抑制与癌前病变加速生长密切相关。这种局部自噬损伤与自噬-溶酶体-内体系统、脂质代谢、氧化应激和内质网应激的系统性转录改变紧密整合，其失衡可能促进脂肪变性相关的早期肝癌发生。鉴于此前自噬诱导剂胺碘酮能抑制癌前病变发展的初步发现，该实验模型为评估靶向自噬诱导剂联合代谢改善药物的新型化学预防策略提供了有用平台。
