《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Development and evaluation of a real-time PCR assay for the detection of bovine Milk in foods
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《联邦食品、药品和化妆品法案》将乳列为主要食物过敏原，并要求在食品包装上标注。因此，需要稳健、灵敏的检测方法以确保标注准确。免疫分析如酶联免疫吸附试验（ELISA）可检测致敏蛋白，但可能受交叉反应性和食品加工过程中蛋白质降解的限制。基于DNA的检测方法通常较少
《联邦食品、药品和化妆品法案》将乳列为主要食物过敏原，并要求在食品包装上标注。因此，需要稳健、灵敏的检测方法以确保标注准确。免疫分析如酶联免疫吸附试验（ELISA）可检测致敏蛋白，但可能受交叉反应性和食品加工过程中蛋白质降解的限制。基于DNA的检测方法通常较少受食品加工影响，是一种稳健的替代方案。本研究开发了一种靶向牛（Bos taurus）COI线粒体基因的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法，并评估其用于检测食品中牛乳源性DNA的可行性。研究人员将已知浓度的牛乳掺入四种复杂食品基质——黑巧克力、纯素饼干、无乳松饼和橙汁中，这些基质的选择基于其与过敏原召回的相关性和稳健性测试需求。由于乳中DNA浓度远低于其他牛组织，研究人员以牛肉作为对照，在平行掺入实验中评估检测性能。该检测方法在食品基质中可检测低至100 ppm的牛乳浓度，但黑巧克力除外，其内部对照表明存在PCR抑制剂。牛肉与牛乳掺入数据的比较表明，该方法对牛乳检测灵敏度较低的原因可归因于牛乳中固有的牛DNA浓度较低。该方法应作为筛查工具使用，或在食品加工已损害致敏蛋白时与免疫分析联合使用。
**论文解读：基于COI线粒体基因的实时PCR检测食品中牛乳方法的研究**
**一、研究背景与问题**
食物过敏在美国的患病率估计高达10%，且在过去二十年中呈上升趋势。其中，牛奶过敏的患病率约为3%。根据《联邦食品、药品和化妆品法案》，乳被列为美国九大受监管的主要过敏原之一。尽管有这些法规，乳在2007年至2019年美国食品召回中是最常被引用为主要过敏原的类别，这一发现与全球食品过敏原召回数据以及2024年美国召回数据一致。值得注意的是，乳是唯一在所有25个食品产品类别中被引用召回的主要过敏原，其中前三类为烘焙产品、面团、烘焙混合料和糖霜；巧克力及可可产品；以及零食食品。由于避免摄入是过敏个体唯一的预防策略，牛奶过敏的普遍性及其在食品供应中的广泛存在，凸显了准确可靠的检测方法以确保正确标注的必要性。
免疫分析是检测致敏蛋白的主要方法。然而，基于DNA的检测方法在蛋白质完整性受损或免疫分析特异性限制致敏蛋白准确检测和定量的情况下，可作为补充工具。商业食品加工实践、基质效应、交叉反应性以及商业试剂盒间的差异均可影响免疫分析对蛋白质的准确检测和定量。基于DNA的方法通常对这些因素不太敏感，能在各种复杂食品基质中提供物种特异性鉴定和灵敏检测，在与ELISA的并排比较中表现良好。然而，基于DNA方法的一个重要局限性在于它们间接检测致敏成分，且无法区分动物组织（即肉类与乳）。在乳检测方面，基于蛋白质的检测可能提供更高的灵敏度，而基于DNA的方法在关注同源蛋白质交叉反应性时可能特别适用于物种验证。
文献充分记载，与其他牛组织相比，乳中DNA浓度固有地较低。乳中的基因组DNA仅来源于体细胞——乳腺脱落的白细胞和上皮细胞——其数量显著低于血液或组织。乳中还含有复杂的微生物组，健康奶牛中细菌载量估计与体细胞计数相当。因此，牛基因靶标不仅丰度低，而且占总DNA的比例也低于其他牛组织中预期值。
尽管低DNA浓度带来挑战，已有多种用于检测牛乳的实时PCR方法被开发出来，主要用于识别奶酪及其他乳制品中的欺诈和掺假。这些研究旨在检测牛乳占其他乳制品的百分比，主要用于认证目的，而非达到过敏原检测所需的低检测水平。很少有研究聚焦于在非乳制食品中检测作为未申报过敏原的牛乳。Villa等人使用乳蛋白浓缩物（MPC）掺入肉类样品，模拟干乳添加到肉制品中的情况。然而，MPC的DNA产量显著高于液态乳，对检测灵敏度构成的挑战较小。因此，这些研究并未完全解决在复杂食品基质中检测液态乳作为成分的挑战——鉴于烘焙产品、零食食品和巧克力是未申报乳召回最频繁的食品类别，这一空白尤为重要。因此，本研究聚焦于开发靶向牛（Bos taurus）COI线粒体基因的实时PCR检测方法，用于检测复杂食品基质中的牛DNA——特别是液态乳。
选择COI线粒体基因靶标有两个主要原因：其物种水平区分生物体的能力已有充分文献证明，以及相对于核基因靶标的高拷贝数。高拷贝基因靶标已被证明可提高检测灵敏度，这在DNA浓度低时（如乳和蛋）尤为有利。对多个线粒体基因靶标（COI、Cyt b、12S）用于实时PCR检测牛DNA的比较显示，三个靶标的灵敏度相当，交叉反应性相似。综合来看，这些发现支持选择COI用于检测方法的开发和评估。
基质的选择基于三个标准：代表乳常见出现的食品（烘焙食品）、与未申报过敏原问题的相关性（即黑巧克力中的乳），以及在已知会降解DNA的条件下（如低pH的橙汁）进行稳健性测试。这些基质也与2013年至2019年FDA食品过敏原召回中涉及的主要产品类别一致。
鉴于乳中牛DNA浓度低的挑战，研究人员将牛肉作为替代组织，以提供更浓缩和更均质的牛DNA来源。牛骨骼肌相对于向乳中贡献DNA的上皮或免疫细胞富含线粒体，导致牛肉中COI线粒体基因靶标的拷贝数更高。通过使用牛肉作为高DNA产量的牛DNA来源评估检测性能，可以区分由检测设计导致的局限性与由乳中固有低牛DNA浓度引起的局限性。牛肉表现良好但乳灵敏度降低表明检测局限由DNA浓度而非检测设计驱动，而两种组织均表现不佳则提示检测方法本身存在根本性局限。
**二、研究技术与方法**
该研究采用了以下主要关键技术方法：实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测技术，靶向牛（Bos taurus）COI线粒体基因；使用DNeasy mini plant kit（QIAGEN）进行DNA提取；掺入实验设计，将全乳和牛肉分别掺入四种食品基质（黑巧克力、纯素饼干、无乳松饼和橙汁）至终浓度0.01至10? ppm；内部扩增对照（IAC）系统以监测PCR抑制；Sanger测序用于扩增子验证；以及依据美国FDA验证指南进行效率、检测限（LOD）、定量限（LOQ）和交叉反应性评估。样本来源包括商业市售食品基质和Zyagen公司（美国加州圣地亚哥）的商品化基因组DNA标准品。
**三、研究结果**
**3.1 PCR性能评价**
在优化PCR条件下，研究人员对牛肉和牛乳DNA在TE缓冲液中的十倍系列稀释液（1 ng/μL至1×10?? ng/μL）进行了十二个重复的检测，评估动态范围、LOD、LOQ、R2值、标准差和反应效率。牛乳标准曲线在五个数量级内呈线性，牛肉在六个数量级内呈线性，R2值均≥0.99，效率分别为102%和89%。牛肉效率89%略低于推荐的90%下限。牛乳的LOD为1000 fg/μL（0.001 ng/μL），牛肉为100 fg/μL（0.0001 ng/μL）。牛乳的LOQ为10,000 fg/μL（0.01 ng/μL），牛肉为100 fg/μL（0.0001 ng/μL）。这些LOD与此前发表的其他牛PCR检测方法一致或更灵敏。
**3.2 食品基质中的检测性能**
**3.2.1 黑巧克力**
黑巧克力因与未申报乳召回相关且对DNA纯化和扩增构成已知挑战而被选为评估基质之一。巧克力含有已知的PCR抑制剂，包括多酚、脂质和多糖。与预期一致，黑巧克力样品掺入牛乳后的初始PCR测试中，靶标DNA和内部对照均无扩增，表明存在抑制剂。将提取样品稀释至总DNA浓度1 ng/μL后实现扩增，但检测仅限于10?和10? ppm掺入浓度。相比之下，同样归一化至1 ng/μL的黑巧克力掺入牛肉样品灵敏度高出两个数量级，可在100 ppm检测到，PCR效率为95%。虽然稀释提取样品可实现扩增，但牛乳和牛肉在黑巧克力中的灵敏度仍低于其他基质，表明即使实现扩增，抑制剂仍可降低检测灵敏度和效率。牛血清白蛋白（BSA）的使用将牛肉检测改善了一个数量级，可在黑巧克力中检测至10 ppm，但对牛乳检测灵敏度无影响。牛肉和牛乳对BSA的不同响应可能表明PCR抑制并非导致牛乳灵敏度受限的唯一因素，与牛肉的直接比较提示乳中靶标DNA拷贝数低也可能是因素之一。
**3.2.2 烘焙食品（纯素饼干和松饼）**
纯素饼干和松饼中掺入牛乳的检测范围为103至10? ppm，PCR效率分别为99%和122%。与黑巧克力掺入实验结果一致，烘焙食品中牛肉的检测灵敏度比牛乳高约三个数量级，饼干和松饼的PCR效率分别为107%和105%，均在实时PCR检测可接受范围内。牛乳在松饼中检测时观察到的高PCR效率可能归因于乳中靶标DNA拷贝数低。低拷贝数反应由于PCR随机性和低靶标浓度下泊松分布采样误差影响更大，更容易出现重复间CT值高变异。这种变异可降低平均CT值的线性度（R2<0.99）、加宽分布、降低标准曲线斜率，从而产生计算反应效率的虚假增加。鉴于该方法在特定基质中相对较低的灵敏度和较高效率，可能更适合作为定性筛查工具。
**3.2.3 橙汁**
橙汁中掺入牛乳的检测范围为102至10? ppm，PCR效率为107%。同一基质中掺入牛肉的检测范围更广，为10?1至10? ppm，PCR效率为104%。两者均在实时PCR检测可接受范围内，表明无明显PCR抑制。虽然牛乳检测灵敏度降低可能提示橙汁的酸性导致DNA降解，但同一基质中牛肉检测灵敏度未受影响，不支持这一解释。数据与牛肉检测比牛乳检测灵敏度高约三个数量级的一致模式相符。鉴于两种靶标的反应效率相似，两种组织间拷贝数差异为观察到的检测灵敏度差异提供了合理解释。
**3.2.4 各基质检测性能比较**
除黑巧克力外，牛乳最低检测量为橙汁中100 ppm、纯素饼干和松饼中1000 ppm。牛乳检测灵敏度相对低于此前FDA验证的动物组织qPCR检测方法，但所有评估基质中牛肉检测灵敏度均比牛乳高三个数量级，且与那些验证方法相当。牛乳和牛肉在所有基质中检测灵敏度的持续差异表明，乳中靶标DNA浓度低于牛肉是牛乳检测灵敏度降低的合理解释。
**3.3 交叉反应性**
交叉反应性评估使用其他相关物种的乳和肉类样品。水牛乳在相同浓度下比牛乳晚六个CT值出现扩增，且扩增较弱，可能归因于引物和探针结合位点与Bos taurus的序列相似性——探针中仅差三个碱基对，反向引物中差一个碱基对。由于水牛乳显著比牛乳昂贵，几乎专用于高端乳制品如手工奶酪、酸奶和酥油，不太可能作为未申报成分出现在食品中，因此这种交叉反应性不被认为有问题。此外，部分肉类样品（即羊肉、山羊肉和猪肉）观察到低水平交叉反应性，平均CT值约为29或更晚，这与其他使用线粒体基因靶标的研究结果一致。
**四、结论与意义**
本研究描述了靶向牛（Bos taurus）COI线粒体基因的实时PCR检测方法的开发和评估，用于检测复杂食品基质中作为致敏成分的液态牛乳。该方法在四种评估基质中的三种可靠检测牛乳，最低检测浓度为橙汁中100 ppm（0.01%）和纯素饼干及松饼中1000 ppm（0.1%）。PCR抑制限制了黑巧克力中的检测。研究的关键发现是，无论基质类型或是否存在PCR抑制剂，牛肉检测灵敏度始终比牛乳高三个数量级。这一模式表明，液态乳中牛DNA浓度低——而非检测设计的根本局限——是牛乳检测灵敏度降低的合理解释。水牛乳的交叉反应性因价格差异和水牛乳作为食品成分的有限使用而不被认为有问题。羊肉、山羊肉和猪肉的低水平交叉反应性与其他使用线粒体基因靶标的研究结果一致，在解释含肉复杂基质结果时应予以考虑。尽管存在灵敏度局限，该方法可一致检测食品中低至0.1%的牛乳，可作为乳作为较丰富成分存在的合适筛查工具，而非用于痕量过敏原污染的检测。在免疫分析中不同反刍动物乳蛋白交叉反应性限制准确过敏原物种鉴定的情况下，该方法也可作为补充的物种鉴定工具。未来提高牛乳检测灵敏度的工作将进一步支持该方法在监管应用中的实用性。
