MCART1（SLC25A51）缺乏会加剧MPP+诱导的复合体I应激状态下的线粒体功能障碍

《Free Radical Biology and Medicine》：MCART1 (SLC25A51) deficiency exacerbates mitochondrial dysfunction during MPP+-induced complex I stress

　　

摘要

线粒体NAD⁺稳态由内膜转运蛋白MCART1维持，这对氧化代谢和应激抵抗力至关重要。1-甲基-4-苯基吡啶inium（MPP⁺）会抑制复合体I的功能，导致代谢崩溃和线粒体功能障碍，但MCART1是否具有抵御MPP⁺毒素的保护作用仍不清楚。本研究显示，在生理条件下，MCART1的缺失会加剧线粒体功能障碍；而在经MPP⁺处理的神经细胞中，MCART1有助于维持膜电位、防止ATP耗尽并抑制活性氧积累。我们在预测的底物结合口袋中找到了关键的NAD⁺结合残基，这些残基的突变会使MPP⁺抗性与持续的NAD⁺转运分离，从而确定了MCART1发挥应激响应保护功能所需的结构要素。这些发现表明，在复合体I中毒情况下，MCART1是维持线粒体完整性的重要保护因子，同时揭示了在与帕金森病相关的MPP⁺毒素模型中，NAD⁺流入途径的失效会导致代谢崩溃。

引言

线粒体在细胞呼吸和能量产生中起着核心作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）是一种重要的代谢辅因子，它通过参与氧化还原反应中的电子传递以及为电子传输链提供能量来推动ATP的合成[1]、[2]。除了参与氧化还原反应外，NAD⁺还是调控非氧化还原过程的酶的底物，这些过程包括线粒体质量控制、DNA损伤修复以及炎症信号传导[3]、[4]、[5]。

随着年龄增长，大脑中NAD⁺含量的下降会打破氧化还原稳态，损害线粒体功能并增加氧化应激，进而加重多巴胺能神经元的脆弱性。这些变化与帕金森病等神经退行性疾病密切相关[6]、[7]、[8]、[9]。多项研究指出，提升NAD⁺水平可改善帕金森病模型中的线粒体缺陷，这表明恢复NAD⁺稳态可能具有治疗意义[10]、[11]。

细胞内的NAD⁺存在不同的区室化分布，其中线粒体中的NAD⁺占细胞总NAD⁺量的很大比例，这也凸显了它在维持整体NAD⁺稳态中的重要性[12]、[13]。MCART1（线粒体载体三重复蛋白1；SLC25A51）最近被确定为哺乳动物线粒体中的NAD⁺转运蛋白，它能将NAD⁺从细胞质转运到线粒体基质中[14]、[15]、[16]。MCART1的缺失会降低线粒体中的NAD⁺含量，进而影响细胞的呼吸作用和ATP生成[16]。通过维持线粒体中的NAD⁺含量以及NAD⁺/NADH比例，MCART1能够支持各种需大量能量的过程，比如癌细胞的增殖和肝脏的再生[17]、[18]、[19]、[20]。此外，MCART1的缺失还会影响依赖于NAD⁺的酶的活性，如SIRT蛋白和聚ADP-核糖聚合酶1，进而影响线粒体蛋白的乙酰化、线粒体自噬以及DNA修复[21]、[22]、[23]。尽管已有诸多研究进展，但MCART1在分子层面是如何识别并转运NAD⁺的，以及它是否能在帕金森病相关的应激环境中增强神经细胞的耐受力，这些问题仍未得到解答。

在本研究中，我们明确了MCART1在MPP⁺诱导的帕金森病细胞模型中的神经保护作用。转录组分析表明，MCART1能够支持与NAD⁺代谢及能量依赖性过程相关的线粒体功能。通过AlphaFold3指导的结构建模、突变实验以及分子动力学模拟，我们找到了NAD⁺识别所必需的关键残基。从功能上来看，MCART1的缺失会在MPP⁺应激下加重线粒体缺陷并导致细胞死亡，而过度表达MCART1则可以恢复线粒体中的NAD⁺水平并保护细胞。尤为重要的是，破坏NAD⁺结合功能会消除这种保护作用，这说明MCART1通过维持线粒体中的NAD⁺稳态来发挥在MPP⁺诱导的应激环境下的神经保护作用。

章节节选

细胞培养与转染

人类HEK293T细胞和SH-SY5Y细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中培养，培养环境为37℃、5%二氧化碳浓度。为了建立帕金森病细胞模型，向SH-SY5Y细胞中加入0.5 mM的1-甲基-4-苯基吡啶（MPP⁺），持续处理24小时。用于过表达或shRNA介导的基因敲低的质粒则是通过脂质体转染法导入细胞中的。

MCART1与线粒体能量代谢过程相关

为探究MCART1在神经细胞中的功能，我们以人类来源的SH-SY5Y细胞为材料构建了MCART1敲低细胞系，随后进行了RNA测序分析（见图1A-B和表S1）。MCART1的缺失会导致参与NAD⁺生物合成和代谢的线粒体基因显著下调，这说明线粒体中的NAD⁺稳态受到了损害（见图1C和补充图1A）。这一结果与先前的研究一致[16]、[19]，线粒体中的NAD⁺

讨论

我们的研究结果表明，MCART1是在急性MPP⁺诱导的复合体I功能受损情况下，维持线粒体NAD⁺稳态及线粒体功能的重要调节因子。当该转运蛋白的活性不足时，毒素作用下线粒体基质中的NAD⁺含量会急剧下降，进而引发一系列生物能量代谢紊乱，包括膜电位丧失、ATP耗尽以及氧化应激，最终导致细胞死亡。相反，提高MCART1的表达水平则能够增强线粒体中的NAD⁺

CRediT作者贡献说明

沈旭瑞：撰写——审阅与编辑，资金获取，正式分析。杨汉亭：撰写——审阅与编辑，指导，资源提供，资金获取，概念设计。张锦伦·凯利安：实验研究，正式分析。孙佩鑫：撰写——审阅与编辑，数据可视化，实验研究，正式分析，数据整理。张悦：实验研究，资金获取，数据整理。王世良：撰写——审阅与编辑，初稿撰写，数据可视化，实验研究，

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性

本研究涉及的所有数据均保存在论文正文及补充数据中。本研究中生成的RNA测序数据已存储在GEO数据库中，访问编号为GSEXXXX。处理后的数据及相关分析结果则放在补充数据部分。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们要感谢复旦大学转化脑科学研究所平台上的江玉丽和吕毅，他们为我们的成像和分子实验提供了大力支持。本研究还得到了中国国家自然科学基金（编号为32171216，资助对象为HY）、中国博士后科学基金会（编号为2023M730689，资助对象为XS）以及复旦大学基础医学科学学院的正益学者研究结题项目的资助（编号为S32-B03，资助对象为YZ）。

王世良|孙佩鑫|张悦|张锦伦·凯利安|沈旭瑞|杨汉亭

复旦大学转化脑科学研究所、脑功能与疾病国家重点实验室及教育部脑科学前沿中心，上海200032，中国