综述：显著的性别差异导致不同的脑疾病表现：以ADNP/达夫奈肽（davunetide）为例的性别特异性药物需求

《Frontiers in Neuroendocrinology》：Dramatic sex differences leading to different brain disease presentation: The requirement for sex-specific medications with ADNP/davunetide as a case study

　　

研究人员聚焦于本实验室发现的大脑必需基因，即活性依赖性神经保护蛋白（ADNP）及其神经保护位点，研究性药物达夫奈肽（davunetide），阐述了ADNP调控类固醇激素生物合成和性染色体基因，并与性别依赖性的核与细胞质之间穿梭过程相耦合。进一步结合性别依赖性的转录调控，ADNP/davunetide的细胞质微管/Tau靶向作用被转化为关键细胞过程（包括神经发生、突触功能和轴突运输）的差异性性别调控，进而解码为多细胞过程中的性别二态性，指导性别依赖性的行为结局。ADNP对这些性别特异性过程的调控可作为达夫奈肽干预的靶点，朝向性别定向的精准医学，揭示了针对tau蛋白病变风险及进展（从冠状动脉旁路移植术（CABG）到前驱期阿尔茨海默病、进行性核上性麻痹（PSP）和精神分裂症，以及儿科ADNP综合征）的性别二态性神经保护作用。达夫奈肽的性别特异性鼻内生物利用度受发情周期调控，为这些差异性结局提供了机制基础。

论文主体部分总结如下：

**1. ADNP和NAP：从发现到药物开发**

**1.1. 活性依赖性神经保护蛋白（ADNP）**
ADNP最初由本实验室（Illana Gozes）发现并专利化，被鉴定为一种受血管活性肠肽（VIP）调控的神经保护蛋白，VIP在脑发育和功能中起重要作用并受发情周期控制。ADNP包含一个飞摩尔级活性的神经保护肽基序，对脑形成至关重要：纯合敲除胚胎表现出严重脑发育缺陷并在子宫内死亡，由此提出“无ADNP即无脑”的概念。ADNP的突变与神经发育综合征、神经精神疾病及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）广泛相关。结构上，ADNP是一种1102个氨基酸的蛋白，包含多个互作结构域（图1）。其新发突变引起ADNP综合征（Helsmoortel-Van der Aa综合征），特征为自闭症谱系障碍、智力残疾和运动功能障碍；此外ADNP基因包含致病性和保护性遗传变异。在细胞核中，ADNP作为SWI/SNF染色质重塑复合体的核心组分，与BRG1、SIRT1、WDR5、HDAC2和YY1相互作用，以性别依赖性方式调控胚胎发生和神经元功能所必需的基因表达程序及组蛋白甲基化。ADNP还结合HP1调控染色质功能，并进一步与CHD4相互作用影响染色质调控通路。条件性Adnp敲除小鼠模型独立证实了其染色质调控作用，ADNP作为ChAHP复合体的核心亚基招募CHD4维持祖细胞增殖并驱动上层新皮层神经元扩增，同时共调控更广泛的神经发育障碍风险基因网络。在神经祖细胞中，ADNP限制基因组CTCF占据，其缺失引发染色质环和基因表达的全基因组改变，对分化过程中维持神经元谱系保真度至关重要。致病性ADNP变异并非都通过简单的功能丧失起作用：罕见的错义变异（p.C687R）破坏第九个锌指结构域，在患者来源的神经祖细胞中产生功能获得样染色质效应，使调控GABA能谱系规范的基因上的组蛋白标记失调。此外，实验室对两种Adnp缺陷小鼠模型的比较提示，最常见的ADNP综合征突变（p.Tyr719*）存在运动功能的毒性获得，进一步在人类研究中得到提示。在细胞质中，ADNP通过其SIP基序与微管末端结合蛋白EB1和EB3结合，还与SIRT1和Tau在微管晶格上相互作用，并通过SH3和肌动蛋白结合域结合SHANK3，从而连接细胞骨架组织、突触结构和神经保护。ADNP还通过14-3-3蛋白以性别依赖性方式在核与细胞质之间穿梭，参与性别特异性的神经元形态发生、皮层连接性和钙信号传导。此外，ADNP在少突胶质细胞中表达，参与髓鞘相关神经发育；在小胶质细胞中表达，与内吞和突触修剪及免疫调节/神经炎症相关；对星形胶质细胞功能也很重要，ADNP缺乏与星形胶质细胞和神经元中早期阿尔茨海默病功能障碍相关。ADNP被鉴定为介导AAV9-Synapsin促进的Caveolin-1（SynCav1）神经保护作用的潜在候选分子，该蛋白是膜脂筏（MLR）支架蛋白，调节质膜微域内的多种促生长和促存活信号通路。ADNP在神经元与其他细胞类型中表现出不同的核和细胞质定位，以性别依赖性方式支持神经元分化和维持中的特定作用。

**1.2. NAP（达夫奈肽）：作用机制**
ADNP的发现直接导致其最小神经保护活性片段——八肽NAPVSIPQ（NAP）的鉴定，随后被开发为研究性药物达夫奈肽（davunetide），也称为鼻内AL-108、静脉AL-208和CP201。NAP可穿越血脑屏障，通过动力蛋白相关内吞作用进入细胞，并易位至细胞核，从而在多个细胞区室中发挥多效性保护作用。NAP中的中央SIP基序介导与微管末端结合蛋白EB1和EB3的相互作用，促进其他含有SxIP的蛋白和ADNP本身向EB复合体的协同招募。这种相互作用增强了EB依赖性的Tau-微管结合，并有助于保护免受tau蛋白病变。用红色荧光蛋白（RFP）-EB1转染的神经元细胞的时间延迟成像显示，与对照组相比，NAP处理增加了微管彗星速度、轨迹长度和彗星密度，与微管动力学改善一致。这些细胞效应与体内轴突运输的保留相关（通过锰增强磁共振成像（MRI）在小鼠中评估），并与微管完整性相关，且表现出性别依赖性差异。除微管调控外，NAPVSIP基序还结合含SH3结构域的蛋白（如SHANK3），将达夫奈肽与肌动蛋白细胞骨架组织和突触功能联系起来。此外，完整的NAPVSIPQ序列与β-连环蛋白的armadillo结构域相互作用，从而支持神经发育和突触可塑性所必需的WNT信号通路。该基序的功能相关性通过在一名表现为肌张力减退、喂养困难和社交恐惧的幼儿中鉴定出的新发错义突变（NAPVSIPQQ→NAPVSIPQE）进一步得到强调。计算机模拟表明，Q→E替换破坏了EB1/EB3、β-连环蛋白和SHANK3结合界面的静电相互作用，导致轻度ADNP综合征表型。此外，D'Incal及其同事在仅雄性小鼠中研究的CRISPR/Cas9产生的携带杂合14碱基对缺失框架移位/截短突变（c.2463_2476del，p.Leu822Hisfs*6）的Adnp小鼠模型，显示出Adnp染色质结合减少以及全基因组染色质可及性增加、前额叶皮层WNT信号通路主要下调以及完整的自闭症相关行为特征（包括认知障碍、焦虑样行为、重复行为和社交互动受损）。这些结果与我们最初的Adnp敲除和单倍剂量不足小鼠数据一致。此外，ADNP/WNT信号最初在单倍剂量不足的Adnp小鼠模型中被描述。最近的框架移位/截短突变模型进一步揭示Adnp直接与Camk2a和Dbn1相互作用以调节突触可塑性，这种相互作用在突变体中受到破坏，导致突触处Camk2a磷酸化异常。Dbn1（drebrin）是一种EB3结合蛋白，最初被证明对神经突发生至关重要，随后在本实验室中被发现与ADNP/davunetide相关。此外，达夫奈肽已被证明通过增加微管相关蛋白1轻链3（LC3）-ADNP关联来促进保护性自噬，进一步支持微管和线粒体功能，并以性别依赖性方式发挥作用。其核转位进一步有助于保护免受ADNP相关转录失调。总的来说，这些发现突出了达夫奈肽的多靶点互作景观。

**2. ADNP、性激素和性别依赖性脑疾病**

**2.1. 脑中的性别差异：一般概述**
大脑从早期胚胎发育到衰老和神经退行性变过程中深受生物性别的影响。男性和女性在分子、细胞和系统水平上存在差异，这些差异是脑疾病风险、进展和治疗反应的关键决定因素。两种最常见的脑疾病生动地说明了这一点：自闭症谱系障碍影响美国约1/31的儿童（8岁），男孩诊断率是女孩的3.4倍；而阿尔茨海默病影响约670万65岁及以上的美国人，女性约占所有患者的三分之二。值得注意的是，这两种疾病可能共享共同的病理基础：微管细胞骨架的不稳定、Tau过度磷酸化和突触功能障碍，但以相反方向表现出显著的性别偏差。在此背景下，研究人员（Gozes及其同事）鉴定出微管蛋白微异质性随大鼠脑成熟而增加，在单个神经元水平上，并将微管蛋白鉴定为哺乳动物突触囊泡膜的整合蛋白。随着ADNP对微管蛋白同种型差异性别调控的发现，研究人员建立了理解细胞骨架生物学如何支撑性别依赖性脑疾病的早期基础，进一步显示了与微管蛋白同种型表达的电磁调控的直接关联。

**2.2. ADNP作为性别特异性脑生物学的主调控因子**
在性别依赖性过程中，ADNP的表达具有显著的性别二态性。在小鼠弓状核中，ADNP mRNA水平在雄性中显著高于所有发情周期阶段的雌性，在间情期最低，在动情后期相对峰值。这种激素调节扩展到人脑，死后海马分析显示男性ADNP mRNA含量显著高于女性。女性较低的基线ADNP对微管保护、Tau稳定性和下游细胞功能有直接影响（图2）。此外，ADNP通过控制类固醇激素生物合成所必需的细胞色素P450酶、Y连锁基因KDM5D、X染色体失活主调控因子XIST以及女性偏向转录因子MEF2C来调控性激素产生，从而在ADNP和性激素系统之间建立双向关系。ADNP以性别依赖性方式调控数百个关键基因。值得注意的是，携带最常见人类ADNP综合征突变p.Tyr719*的小鼠同源物（p.Tyr718*）的CRISPR/Cas9编辑Tyr模型的海马组织RNAseq显示，雌性和雄性Tyr小鼠之间的基因表达模式完全分歧，雌性表现出线粒体基因（特别是MT-ATP6）失调，雄性表现出UPR激活，两者均被达夫奈肽部分恢复正常。这些显著的海马性别差异在基因表达中并非Adnp突变小鼠脑所独有，研究人员在相同小鼠品系的脾脏中发现了性别差异，类似发现也扩展到神经退行性人类。在细胞质中，ADNP/davunetide通过EB蛋白将Tau招募至微管，雌激素和睾酮分别独立增强微管完整性并保护免受Tau过度磷酸化，为以下章节描述的达夫奈肽性别依赖性效应提供了机制基础。基于此，ADNP突变通过tau蛋白病变在神经发育和神经退行性变之间建立了直接的病理桥梁，与越来越多的证据一致，即自闭症谱系障碍和神经退行性疾病在更广泛的生命周期连续体中共享部分重叠的生物学机制，而非完全不同的实体。具体而言，一名7岁ADNP综合征男孩死后海马和小脑组织的Gallyas银染显示显著的Tau沉积，证明在ADNP功能障碍背景下tau蛋白病变可早期出现。在阿尔茨海默病脑中，体细胞ADNP突变随Braak分期逐渐积累，通过死后梭状回组织的RNAseq鉴定出最频繁的突变（p.Arg730Thrfs*4），与tau蛋白病变严重程度直接相关。值得注意的是，NAP增强微管动力学并进一步显著增强Tau-微管结合，修复ADNP突变诱导的Tau与微管分离，从而导致tau蛋白病变。ADNP/NAP进一步调节Akt通路，该通路反过来控制WNT信号，作为Adnp单倍剂量不足控制的关键蛋白，在Tyr小鼠（p.Tyr718*）的雌性脾脏中更加突出。重要的是，Akt主要通过磷酸化并失活GSK3β来调节WNT信号，从而减少Tau过度磷酸化并保护免受tau蛋白病变，正如先前对NAP/ADNP作用机制所示。类似地，睾酮通过Akt通路抑制GSK3β激活，抑制Tau过度磷酸化。雌激素，特别是17β-雌二醇，直接与微管和Akt/PI3K细胞存活通路相互作用。因此，微管结合蛋白造血PBX相互作用蛋白（HPIP）介导β-微管蛋白和雌激素受体α之间的相互作用。有趣的是，最近一项工作显示，在原发性年龄相关tau蛋白病变（PART）女性患者死后脑组织中，tau蛋白病变进展更快，与男性患者相比，伴随着过度磷酸化Tau的增加，这在细胞培养模型中部分被雌二醇改善。机制上，ADNP缺乏导致微管不稳定、Tau过度磷酸化、神经元功能进行性丧失和细胞死亡。一个独立的、已确定的性别依赖性调控机制进一步控制ADNP的亚细胞定位：在神经突形成过程中，ADNP在候选丝氨酸-42位点被蛋白激酶C（PKC）磷酸化，促进其与14-3-3蛋白结合并从核穿梭至细胞质；这种穿梭与雌性特异性神经元自发钙活动、GAD67表达和半球间皮层连接性增加相关，在雄性中未观察到类似效应。这种核-细胞质机制与更广泛的性染色体和蛋白质稳态对疾病的贡献汇合：提出更强的母体X染色体表达偏向可能是女性对认知衰退更大易感性以及更大治疗反应性的基础，同时，先前沉默的X连锁基因的重新激活被认为是女性神经退行性变恢复力的途径；ADNP/SIRT1复合体进一步将核中的组蛋白调控与细胞质中EB1/EB3依赖性微管保护联系起来，而达夫奈肽纠正的未折叠蛋白反应失调仅发生在雄性中。在突触水平，ADNP在35584个个体的全外显子组测序中被鉴定为顶级自闭症谱系障碍基因之一，与其他ASD相关突触蛋白如SCN2A、SYNGAP1、CHD8和SHANK3并列。ADNP直接与其他自闭症相关基因产物（如SHANK3）相互作用，SHANK3与自闭症Phelan-McDermid综合征以及精神分裂症相关。重要的是，ADNP综合征（也称为Helsmoortel-Van der Aa综合征）本质上是突触疾病，受染色质和微管性别调控/调控机制的影响。

**2.3. 临床前模型中性别依赖性的ADNP缺陷及NAP治疗**
为剖析ADNP在体内的性别依赖性作用，鉴于完全ADNP敲除呈现胚胎致死性，Gozes实验室开发了六种涵盖ADNP功能障碍谱系的小鼠模型：原始Adnp^+/-杂合模型、Adnp^+/- ICR背景模型、相同模型的GFP神经元报告版本、CRISPR/Cas9编辑的Tyr模型（p.Tyr718*，与人热点突变p.Tyr719*同源）及其GFP报告版本，以及肌肉特异性CRISPR/Cas9敲低模型。这些模型共同表明，ADNP缺陷产生广泛的、性别依赖性的表型，这些表型被达夫奈肽治疗持续改善。可存活的Adnp^+/-杂合小鼠成为部分ADNP缺陷的基础模型，表现出Morris水迷宫学习和记忆受损，训练天数内逃避潜伏期未能降低，同时伴有AT8免疫染色可检测的Tau过度磷酸化，行为缺陷和分子病理均被NAP（davunetide）治疗显著挽救。扩展到更广泛的行为特征，Adnp^+/-小鼠在多个领域表现出性别依赖性缺陷：雄性在悬挂线和握力测试中显著受损，而雌性社交识别和气味辨别受损，两性均观察到物体识别和社交记忆缺陷，所有这些均被达夫奈肽治疗改善（图3）。Adnp^+/-基因型还表现出超声发声（USV）显著减少和发育里程碑延迟，每日NAP治疗部分逆转表型。例如，在离乳后（P8）幼鼠中，与母鼠分离后诱导惊恐USV（40-70kHz）。分离雌雄显示雌性幼鼠显著抑制，被每日NAP治疗完全逆转。在雄性幼鼠中，NAP诱导的发声增加更为显著。此外，鉴定出性别依赖性的应激易感性，雄性在认知领域表现出更大脆弱性，雌性在焦虑相关行为中，脾脏ADNP表达和皮质醇水平与这些性别特异性结果相关，并在人类队列中进一步证实。ADNP缺陷还产生性别二态性的肠道微生物群组成变化，NAP以性别依赖性方式纠正这些变化，将肠道微生物群确立为ADNP综合征的新型性别依赖性生物标志物。在突触水平，雄性Adnp^+/-小鼠与雌性相比，海马树突棘密度减少更严重，轴突棘突触增加，两性均表现出不同的性别特异性突触损伤模式，达夫奈肽以性别适宜的方式使其正常化。在突触前水平，ADNP缺陷特异性减少雄性海马谷氨酸能突触（VGLUT1），NAP完全恢复VGLUT1表达，而雌性海马VGLUT1不受影响，进一步证明谷氨酸能突触对ADNP缺陷的性别特异性脆弱性。Adnp^+/-小鼠表现出非典型听觉脑干反应和影响大脑区域谷氨酸能/GABA能传递的性别依赖性蛋白表达变化，与超过10% ADNP综合征儿童报告的听力障碍一致。在前额叶皮层，携带截短Adnp C末端（p.Leu822Hisfs*6）的14核苷酸缺失的杂合小鼠显示谷氨酸能和GABA能突触传递显著减弱，缺陷程度存在性别差异；组蛋白去甲基化酶LSD1抑制剂治疗恢复这些电流，效应在雌性中更为显著，并与组蛋白标记的性别特异性变化和突触基因表达升高相关。值得注意的是，ADNP调节对滥用物质的性别特异性反应：可卡因差异性地降低雄性而非雌性的ADNP表达，而ADNP作为雌性特异性酒精消耗的负调控因子，Adnp^+/-雌性显示饮酒增加和复发脆弱性，被NAP治疗正常化，雄性未观察到此类效应。此外，Kapitansky等人证明ADNP对肌肉基因表达的年龄和性别依赖性调节，与整个生命周期的运动行为相关，Adnp^+/-缺陷在腓肠肌、舌和膀胱中产生性别二态性异常，均被NAP治疗纠正。有趣的是，肌肉特异性CRISPR敲低Adnp产生性别依赖性的运动功能障碍，如雄性跑步机障碍和雌性步态障碍，两者均被NAP治疗特异性纠正。在杂合模型基础上，Adnp Tyr小鼠（p.Tyr718*）揭示了戏剧性的性别特异性外周基因表达差异、性别特异性微生物群变化以及脑突触和Tau病理。雌性Tyr小鼠表现出更多步态障碍，被NAP（davunetide）改善，而雄性Tyr小鼠在视觉皮层显示显著tau蛋白病变，伴随多个亮度水平视觉诱发电位受损，并被NAP（davunetide）治疗纠正。此外，Tyr突变与其他ADNP突变相比产生更严重的核膜破坏表型，该效应随年龄增长而恶化，并被NAP核转位部分挽救。引人注目的是，如上所述，海马组织RNAseq揭示雌性和雄性Tyr小鼠之间完全不同的基因表达模式，证明ADNP通过雌性线粒体基因调控（特别是MT-ATP6）和雄性未折叠蛋白反应激活，对性别依赖性海马神经发生至关重要，两者均被达夫奈肽部分正常化。这些发现由携带ADNP移码变体的新ADNP动物模型证实，该模型显示性别依赖性组蛋白甲基化。最后，衰老ADNP综合征小鼠表现出突变/性别依赖性的运动行为和昼夜节律紊乱。

**3. 性别依赖性的达夫奈肽保护：临床证据**
达夫奈肽具有广泛的临床前和临床记录，已在神经发育、神经退行性、神经精神病学和急性脑损伤模型中证明了概念验证性神经保护作用。在11项临床试验中超过560名成人中确立了安全性。对于ADNP综合征，达夫奈肽已获得FDA孤儿药和罕见儿科疾病认定，并已提出关键III期研究，获得FDA强力支持和EMA孤儿药品认定。性别依赖性达夫奈肽效应的临床证据来自针对不同tau蛋白病变背景的几项独立试验（图4）。冠状动脉旁路移植术（CABG）手术带来急性tau蛋白病变风险，CABG直接与脑脊液Tau浓度显著升高和术后认知能力下降相关。在一项II期临床试验（单次静脉注射达夫奈肽（AL-208））的事后性别分层分析中，首次揭示了性别特异性血浆药代动力学，男性显示随时间剂量依赖性药物积累，而女性显示相反模式，提示女性代谢更快。血浆神经元特异性烯醇化酶（NSE）（神经元损伤生物标志物）显示显著的性别特异性神经保护轨迹，在女性中突出，达夫奈肽与安慰剂相比显著改善男性延迟性言语记忆，达到正常水平，这种改善在女性中未观察到，且女性未受损。转向混合型tau蛋白病变，在一项针对前驱期阿尔茨海默病（遗忘型轻度认知障碍）的双盲、安慰剂对照12周试验中，鼻内达夫奈肽显示出惊人的性别依赖性结局。男性表现出剂量依赖性的短期视觉记忆增强，而女性也表现出显著的高剂量达夫奈肽对注意力和言语记忆的增强，以及对视觉记忆的有限增强。此外，焦虑和认知在女性中表现出性别相反的关联，强调需要性别特异性的前驱期阿尔茨海默病药物开发。在进行性核上性麻痹（PSP）（一种纯tau蛋白病变）中，一项涉及200多名患者的52周II/III期临床试验的事后性别分层分析揭示了惊人的性别差异。安慰剂组女性比男性表现出更快的神经退行性变。每日两次鼻内达夫奈肽显著减缓女性疾病进展，在日常生活活动（SEADL）、延髓功能和肢体运动领域提供保护，而安慰剂组男性疾病进展显著较慢。使用FDA推荐的PSPRS-10结局指标进一步证实了这一点，该指标揭示了对女性有利的显著治疗效应（考虑时间、性别和治疗交互作用时P=0.0005），同时达夫奈肽在女性中显著改善语言和字母数字排序，并保留独立日常活动（如使用餐具和扣纽扣）。这些结果共同揭示了基于性别的药物疗效差异，证明了达夫奈肽在女性PSP患者中具有神经保护和疾病修饰作用（图4），并显示出与tau蛋白病变的相反分子性别相关性。在这些性别依赖性临床结局背后，鼻内达夫奈肽的生物利用度受发情周期调控。小鼠体内成像显示，雌性大脑生物利用度显著高于雄性，特别是在动情前期和动情期（对应于最高雌激素水平）。在健康人群中，鼻内达夫奈肽给药后的血浆药代动力学趋向于女性峰值浓度更高，男性半衰期更长，与临床前发现和既往临床试验一致，强调需要性别特异性脑部药物。通过对雌性小鼠进行双侧卵巢切除术（OVX）作为雌激素耗竭模型，每日鼻内NAP阻止了前肢握力的显著下降，效应与雌激素替代相当，提示NAP作为管理雌激素丢失相关肌肉骨骼症状的可行非激素替代方案。除tau蛋白病变外，在死后精神分裂症脑组织和患者淋巴细胞中鉴定出ADNP失调和自噬受损，特别是女性患者中与疾病进展呈负相关，NAP在精神分裂症小鼠模型中使基因表达和认知正常化。临床上，达夫奈肽在一项63名精神分裂症患者的双盲安慰剂对照试验中显示出功能性能力的显著改善，并通过磁共振波谱测量在背外侧前额叶皮层显示出潜在的神经保护作用。最后，将这些发现转化为儿科ADNP综合征，对15名年龄1至27岁的ADNP综合征个体进行纵向Vineland-3评估，揭示了发育迟缓和停滞，所有个体无论实际年龄如何，均获得仅1至6岁的年龄等效评分。沟通能力尤其受影响，突变的ADNP蛋白长度与沟通能力之间存在显著相关性，主要由男性驱动，女性可能表现出更好的结局，但需要进一步研究确认性别特异性效应。结合机制和临床前/临床结局，图5总结了上述章节中阐述的ADNP/NAP（davunetide）性别依赖性机制。