《Journal of Virology》：Intragenic transcription from defective HIV proviruses triggers interferon responses in myeloid cells
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持久性HIV-1储存库包括一个细胞亚群，这些细胞携带转录抑制的潜伏HIV-1，在抗逆转录病毒治疗（ART）中断时会导致病毒反弹。然而，储存库的大部分由缺陷型前病毒基因组组成，这些基因组带有阻止HIV-1病毒颗粒产生的突变。感染HIV的人（PWH），即使病毒血症
持久性HIV-1储存库包括一个细胞亚群，这些细胞携带转录抑制的潜伏HIV-1，在抗逆转录病毒治疗（ART）中断时会导致病毒反弹。然而，储存库的大部分由缺陷型前病毒基因组组成，这些基因组带有阻止HIV-1病毒颗粒产生的突变。感染HIV的人（PWH），即使病毒血症被抑制，也会表现出中枢神经系统、心脏、肠道和一般衰老相关炎症的合并症。此前，研究人员在HIV-1的包膜基因（env）内发现了一个转录活性元件，该元件介导异常HIV-1 RNA的表达。研究人员假设，缺陷型前病毒的异常表达有助于驱动这些合并症的全身性炎症。研究人员观察到PWH血清中炎症细胞因子水平与该基因内启动子产生的HIV-1转录本水平之间的相关性。为了研究缺陷型前病毒的影响，研究人员采用CRISPR-Cas9使5′长末端重复序列（LTR）失活，该序列作为前病毒转录的增强子和启动子。携带该缺失的HIV-1感染细胞在体外单核细胞系和原代单核细胞来源的巨噬细胞中产生显著更高水平的IP-10和IL-8。从env启动子产生的转录本包含5′帽和polyA尾，IP-10表达的诱导依赖于胞质先天免疫感知通路成分MDA5和MAVS，而非cGAS和RIG-I。研究人员提出，缺陷型HIV前病毒通过MDA5依赖的I型干扰素通路诱导，导致PWH的慢性炎症。
论文解读：缺陷型HIV前病毒通过MDA5信号通路触发慢性炎症的机制研究
研究背景与问题：HIV-1感染是全球性公共卫生问题，尽管有效抗逆转录病毒治疗（ART）可抑制病毒复制，但PWH仍面临多种合并症，如神经缺陷、心血管疾病和加速衰老，这些与慢性低度炎症密切相关。即使ART抑制病毒血症，PWH体内仍存在持续炎症，其机制尚不完全清楚。HIV-1储存库主要由转录沉默的潜伏前病毒和缺陷型前病毒组成，后者因突变无法产生完整病毒颗粒，但可能仍具有转录活性。先前研究在env基因内发现一个介导异常RNA表达的启动子样元件，但此类RNA对炎症的影响未被深入探索。因此，本研究旨在探讨缺陷型前病毒的基因内转录是否通过先天免疫感知触发I型干扰素反应，从而驱动慢性炎症。
研究内容与结论：研究人员提出假设，缺陷型前病毒的异常转录可能诱导炎症反应。为验证此假设，他们分析了22名接受ART且无病毒血症的PWH队列（来自“inflammaging”研究），发现血清细胞因子（TNF-α、IP-10、IL-8）水平与缺失5′非翻译区（UTR）的HIV-1 RNA（由基因内启动子产生）显著相关，而总HIV-1 RNA或含UTR的RNA无此关联。体外实验中，通过CRISPR-Cas9删除整合的HIV-1前病毒5′长末端重复序列（LTR），在Jurkat细胞和单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）中模拟缺陷前病毒，发现IP-10和IL-8表达显著升高，而TNF-α无关。这些RNA具有5′帽和polyA尾结构，表明其可被翻译。进一步敲低MDA5或MAVS后，IP-10诱导被消除，而cGAS或RIG-I敲低无影响，证明该反应依赖MDA5-MAVS信号通路。本研究首次揭示缺陷型HIV-1前病毒的基因内转录通过MDA5触发I型干扰素反应，为理解HIV-1相关慢性炎症提供了新机制，并强调缺陷前病毒在长期病理中的重要性。
关键技术方法：研究使用了多种关键技术。首先，从美国罗德岛血液中心获取血液样本，通过Ficoll梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs），并利用CD14+磁珠分选纯化单核细胞，经M-CSF诱导分化为MDMs。临床样本来自22名PWH，其血清细胞因子水平通过酶联免疫吸附试验（ELISA）测定。对于病毒实验，使用VSVg假型的NL4-3病毒（MOI=1.0，Jurkat细胞为0.2），并通过CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）转染删除5′LTR区域，以制造缺陷前病毒。转录水平通过多重RT-ddPCR和RT-qPCR量化，5′帽检测通过eIF4E-GFP拉下实验，polyA尾通过oligodT引物cDNA合成验证。干扰素反应通过HEK-293-ISRE-Luc报告细胞系评估。统计使用Pearson相关和多元线性回归分析临床数据，体外实验用ANOVA和配对t检验。
研究结果：
1. **PWH中细胞相关UTR缺陷转录本与血清细胞因子水平相关**：通过多重RTddPCR量化22名PWH的PBMCs中HIV-1 RNA亚型，发现UTR缺陷RNA（由基因内启动子产生）与IP-10（P=0.0353）、TNF-α（P=0.0213）和IL-8（P=0.0375）显著正相关，调整年龄、性别和ART时间后仍显著，而总RNA和含UTR RNA无此关联。
2. **缺陷型前病毒在体外诱导IP-10和IL-8产生**：在Jurkat-Cas9细胞中，CRISPR删除5′LTR后，利用HEK-293-ISRE-Luc报告细胞检测到约3倍I型IFN诱导。在MDMs中，删除5′LTR后，IP-10 mRNA增加75至1000倍，蛋白增加3至4倍，IL-8 mRNA也显著上调，但TNF-α和IRF1无变化。对照（如hprt基因编辑）不诱导反应，证明特异性。
3. **UTR缺陷RNA的特征**：通过eIF4E拉下实验和polydT引物cDNA合成，确认这些RNA具有5′帽和polyA尾，表明其类似于mRNA，可能被翻译。
4. **MDA5和MAVS是缺陷前病毒诱导IP-10的必要条件**：在THP1细胞系中敲低MDA5或MAVS后，缺陷前病毒不再诱导IP-10，而敲低cGAS或RIG-I无影响，证明该反应特异依赖MDA5-MAVS通路。
讨论与结论：本研究提出，缺陷型HIV前病毒通过env内启动子持续转录，产生5′帽和polyA尾的RNA，这些RNA被MDA5识别，通过MAVS信号触发I型干扰素反应，导致IP-10和IL-8等炎性因子分泌，从而推动慢性炎症。此机制与先前发现的HIV-1未剪接RNA诱导IFN一致，但本研究首次聚焦于缺陷前病毒。研究还推测这些RNA可能被翻译成蛋白质，进一步影响T细胞反应。结论指出，缺陷型HIV前病毒是长期慢性HIV-1发病机制的关键因素，在设计治疗和治愈策略时必须考虑其炎症贡献。该发现为改善PWH的生活质量和健康老龄化提供了新靶点。
