2.3.4.4b分支H5N1血凝素获得特异性人呼吸道结合能力需多个突变

《Journal of Virology》：Acquisition of specific human respiratory tract binding by 2.3.4.4b H5N1 hemagglutinins requires multiple mutations

　　

已有研究提示，源自牛感染人的2.3.4.4b分支病毒A/Texas/34 H5N1（H5TX）的血凝素（hemagglutinin，HA）仅需Q226L单个突变即可从结合禽型受体切换为结合人型受体偏好。本研究检测了H5TX Q226L及其他关键突变体与人气管切片的结合能力。研究人员得出结论：尽管H5TX Q226L可结合人型受体，但该蛋白结合人呼吸道组织需多于一个突变。研究还报道了另一2.3.4.4b HA突变体H5FR Q226L（源自A/duck/France/161108/16 H5N8）的受体结合特异性变化，该变化与多碱基切割位点（multibasic cleavage site，MBCS）的存在相关。本研究为当前流行H5Nx病毒向人型受体结合进化的决定因素提供了见解，并强调在使用合成糖链之外，采用包括基于组织的方法在内的多种手段检测单个毒株的重要性。

研究背景与立项依据

高度致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）H5病毒2.3.4.4谱系持续向新宿主物种扩张，2024年2.3.4.4b分支H5N1在美国多州奶牛群中首次实现持续传播，并伴随人偶发感染，临床症状以轻度呼吸道表现和结膜炎为主。文献提出循环中的2.3.4.4b H5 HA仅需Q226L单点突变即可将受体偏好由禽型α2,3-连接唾液酸（sialic acid，SIA）转向人型α2,6-连接SIA，但既有结论主要依赖合成糖链微阵列，缺乏对人上呼吸道组织的直接验证；同时MBCS对HA受体结合特性的影响此前未系统评估。为明确当前流行牛源H5N1代表人株A/Texas/37/24 HA（H5TX）是否真仅需Q226L即可结合人呼吸道，并探明MBCS的作用，研究人员在《Journal of Virology》报道了下述工作。

主要技术方法概览

研究人员采用HEK293S GnTI(?)细胞表达带mOrange2、GCN4三聚化域及Twin-Strep标签的HA三聚体，经Strep-Tactin纯化；使用含1–4个LacNAc重复的非唾液酸化、α2,3-及α2,6-连接SIA合成糖链微阵列与链霉亲和素包被板糖链ELISA（检测3-SLN₃、6-SLN₃、N-6-SLN₃）定性定量结合；以人、鸡红细胞血凝试验辅助；核心组织学验证使用荷兰乌得勒支大学医学中心捐献人源气管与结膜、乌得勒支大学兽医病理系鸡气管石蜡切片，经抗原修复后行HA-抗体预复合物AEC/荧光染色评估原位结合。跨毒株对比还纳入A/duck/France/161108/16（H5FR）、A/black swan/Akita/1/16（H5AK，2.3.4.4e）、A/Indonesia/05/2005（H5IN）及人源A/Puerto Rico/8/1934 H1N1（H1PR8），并对部分HA定向插入或删除MBCS。

研究结果

H5TX Q226L fails to bind the human trachea

糖链微阵列显示H5TX野生型（WT）结合α2,3-连接糖链，Q226L突变体完全丢失α2,3结合，仅极弱结合含3–4个LacNAc的α2,6-连接三/四聚体（如#18）。血凝试验中Q226L对人红细胞结合极弱；组织染色中H5TX WT结合鸡与人间气管，而Q226L在两种气管均丧失结合。表明Q226L诱导的α2,6转向仅针对长链复杂N-糖，而人上呼吸道缺乏此类糖链，故单突变不足以获得人气管结合。

H5TX N224K Q226L partially rescues binding to human trachea sections

引入N224K与Q226L组合后，糖阵列偏好α2,6双天线含3–4 LacNAc部分不对称唾液酸化糖链；人气管切片中该双突变体恢复散在杯状细胞结合（不结合鸡气管，不结合奶牛乳腺与人间结膜），而WT结合气管上皮顶域与杯状细胞、乳腺及结膜。说明N224K Q226L可部分挽救人气管结合但靶向糖链种类不同于WT，且丧失乳腺/结膜嗜性。

The Q226L mutation is not sufficient for the H5TX HA to fully switch binding to α2,6-linked SIA

借鉴2.3.4.4e H5AK Q226L完全切换表型，将Δ133L与R227Q单独或组合引入H5TX Q226L背景。单突变Δ133L或R227Q不影响气管结合；但与Q226L组合（双突或三突Δ133L Q226L R227Q）均在鸡/人气管切片丢失结合。糖链ELISA中Q226L驱动N-6-SLN₃结合，R227Q可消除该结合，三突部分恢复N-6-SLN₃结合但仍不结合人气管。证明H5TX背景下Q226L外加Δ133L/R227Q不能复刻H5AK的全切换，长链双天线N-6-SLN₃不在人上气道呈现。

The multibasic cleavage site influences receptor binding in a background-dependent manner

H5FR与H5TX仅6个残基差异且前者无MBCS、后者有MBCS。糖阵列示H5FR WT有无MBCS均结合α2,3；H5FR Q226L无MBCS时保留α2,3并获得复杂α2,6结合，有MBCS时完全丢失α2,3、仅结合长α2,6；组织染色中H5FR Q226L有MBCS在鸡/人气管均无结合。H5TX WT/Q226L有无MBCS表型不变。ELISA印证上述趋势。说明MBCS不直接改变受体结合位点（receptor-binding site，RBS）但可经HA加工/构象动态间接干扰特定背景（H5FR Q226L）的受体使用。

The insertion of a multibasic cleavage site across different strains does not affect HA receptor-binding properties

向低致病H5IN（含/不含Q226L）及人H1PR8插入MBCS，血凝、红细胞结合与糖链ELISA均未现受体特异性改变（H1PR8插入后仅见亲和力略降）。证实MBCS对受体特异性的影响具背景依赖性，非普遍规律。

讨论与结论翻译

讨论指出，H5TX Q226L的α2,6转向仅限于延长复杂N-糖，不代表人气管真实受体；N224K Q226L部分恢复人气管杯状细胞结合，提示不对称N-糖分支数/唾液酸化位置关键；H5TX背景下补入Δ133L/R227Q无法复刻H5AK全切换，证明单突Q226L不足。奶牛乳腺含α2,3/α2,6混合SIA，或作中间适应宿主。MBCS通常不改受体特异性，但H5FR Q226L背景下有MBCS致丢失α2,3结合，属首报现象，机制需结构学跟进。研究者强调合成糖链与ELISA受限，必须辅以组织切片验证。

结论译述：当前循环2.3.4.4b病毒HA结合人呼吸道组织需多于一个突变；糖链架构（分支长度、LacNAc重复数、不对称唾液酸化）与MBCS背景依赖效应均不可低估；各抗原背景须独立评估点突变及MBCS对受体结合亲和力与特异性的影响。