《Journal of Virology》：Integration of a multimeric STAT consensus site into the adenoviral genome to interfere with IFN signaling represents a novel concept to improve oncolytic virotherapy
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腺病毒感染会触发干扰素（IFN）应答，该应答在腺病毒生命周期早期减少病毒基因组复制。在溶瘤病毒疗法中，病毒复制对于有效的细胞裂解至关重要，这随后可激活针对肿瘤的全身性免疫应答。研究人员证明，JAK/STAT蛋白家族的不同成员在膀胱癌来源的细胞中冗余性地参与抑制
腺病毒感染会触发干扰素（IFN）应答，该应答在腺病毒生命周期早期减少病毒基因组复制。在溶瘤病毒疗法中，病毒复制对于有效的细胞裂解至关重要，这随后可激活针对肿瘤的全身性免疫应答。研究人员证明，JAK/STAT蛋白家族的不同成员在膀胱癌来源的细胞中冗余性地参与抑制腺病毒复制。该机制需要E1A的表达；然而，它并不影响E1A的表达水平，而是影响其对E1B55K、特别是E4的反式激活。研究人员开发了一种新概念，通过将多聚体STAT共识序列引入溶瘤病毒XVir-N-31的E3区（所得病毒命名为XVir-N-14），以此从宿主细胞中隔离STAT亚型。该病毒在复制、细胞裂解和颗粒形成方面均表现出比XVir-N-31更高的效力。这种将DNA结合分子隔离到病毒基因组中的方法，可能为与JAK/STAT抑制剂联合治疗提供一种替代方案，后者不仅会抑制所期望的全身性免疫应答，还会引起严重的不良反应。
重要性：溶瘤病毒疗法的成功应用需要高效的病毒复制，而宿主细胞的抗病毒IFN应答可能抑制该过程。本研究扩展了对膀胱癌细胞中潜在分子机制的理解。抑制JAK/STAT活性可诱导E1A依赖性早期基因表达上调，尽管E1A表达水平未受影响。在病毒基因组中过表达E1B55K或E4orf6时未观察到该效应，表明STAT分子对E1A的反式激活能力具有调控作用。研究人员开发了一种新概念，通过在溶瘤病毒XVir-N-31的E3区克隆多聚体STAT共识序列来干扰JAK/STAT信号通路。所得病毒XVir-N-14表现出改善的复制、细胞裂解和颗粒形成能力。将分子抑制因子捕获到病毒基因组中，补充了以往通过克隆靶向JAK/STAT信号通路的shRNA或分子抑制剂来改造宿主免疫应答的策略。
**研究背景、现有问题与研究目的**
溶瘤病毒疗法是一种新兴的癌症免疫治疗手段，近期临床试验数据已凸显使用溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的有效性与安全性。优化溶瘤病毒（OV）疗法的关键挑战之一，在于控制病毒复制期间宿主的抗病毒免疫应答。该应答主要由干扰素（IFN）信号调控，进而激活JAK/STAT信号通路。IFN激活经典JAK/STAT级联反应，导致STAT蛋白二聚化、核转位、DNA结合以及多个IFN刺激基因（ISG）的转录调控。尽管腺病毒编码多种蛋白（如E1A、E1B55K、E4orf3）对抗宿主免疫防御，但IFN刺激仍能降低腺病毒复制。因此，靶向JAK/STAT通路是优化溶瘤病毒疗法的潜在策略。本研究旨在深入理解JAK/STAT通路干扰腺病毒复制的机制，并开发新型策略以改善溶瘤腺病毒XVir-N-31的复制与溶瘤效力。XVir-N-31因缺失E1A13S、E1B19K及E3区，可在表达Y-box蛋白1（YB-1）的癌细胞中条件性复制，但其复制速度较野生型腺病毒慢。
**研究内容与结论**
研究人员通过使用JAK1/2抑制剂（Ruxolitinib、Itacitinib）和STAT3抑制剂（Napabucasin）以及靶向STAT1、STAT3、STAT5的siRNA，在多种膀胱癌细胞系中证实，抑制JAK/STAT信号能协同增强溶瘤腺病毒（Ad5-dE3-RGD和XVir-N-31）的细胞裂解、复制及病毒颗粒形成。机制上，JAK1/2抑制可上调E1B55K、E2A和E4的mRNA及蛋白水平，但E1A表达水平不受影响，且该效应完全依赖于E1A的表达。通过构建过表达E1B55K或E4orf6的病毒（XVir-N-5、XVir-N-6），发现E4orf6是介导JAK抑制效应更主要的基因。进一步，STAT1、STAT3、STAT5的敲低以冗余且不依赖磷酸化的方式增强病毒复制。基于此，研究人员设计了一种新策略：将10×多聚STAT共识序列（STAT-TRAP）克隆入XVir-N-31的ΔE3区，构建新型溶瘤病毒XVir-N-14。该病毒在感染后表现出STAT1特异性结合该序列，复制能力提升约11.3倍（24小时），细胞裂解率从25%提高至45%，且早期基因（E2A、E4orf6）表达显著上调，而E1A表达不受影响。
**重要意义**
该研究提出了一种通过隔离STAT蛋白以优化溶瘤病毒疗法的新概念，发表于《Journal of Virology》。这种方法避免了使用JAK/STAT抑制剂可能导致的全身性免疫抑制和严重不良反应，为改善溶瘤腺病毒的复制与溶瘤效力提供了可推广的策略。
**主要关键技术方法**
1. 细胞系与样本来源：使用膀胱癌细胞系T24、5637、UM-UC-3及T24shRb（稳定表达Rb1shRNA的T24细胞系），均来自ATCC或合作实验室。
2. 小分子抑制剂处理：使用Ruxolitinib（JAK1/2抑制剂）、Itacitinib（JAK1抑制剂）、Napabucasin（STAT3抑制剂）预处理细胞。
3. 病毒构建与生成：通过化学合成10×STAT共识序列，克隆至XVir-N-31的ΔE3区，生成XVir-N-14；类似地构建CMV启动子驱动的E1B55K或E4orf6过表达病毒（XVir-N-5、XVir-N-6）。
4. DNA pull-down与染色质免疫沉淀（ChIP）：验证STAT1与STAT-TRAP序列的特异性结合。
5. 基因表达与蛋白分析：实时定量PCR（qPCR）检测病毒基因拷贝数与mRNA水平；免疫印迹（western blot）检测蛋白表达。
**研究结果**
**Effect of JAK1/2 inhibition on oncolytic adenoviral therapy in bladder cancer cells**
通过IFN-α或IFN-γ处理证实IFN信号抑制XVir-N-31复制约30%–50%。JAK1/2抑制剂（Ruxolitinib）与腺病毒联用，在UM-UC-3、T24、5637、T24shRb细胞中均产生协同细胞毒性，且不受Rb状态影响。
**Inhibition of JAK/STAT signaling provokes a rapid, direct increase in viral replication and particle formation**
Ruxolitinib使Ad5-dE3-RGD复制增强2–3倍，XVir-N-31增强4–6倍；Itacitinib和Napabucasin效果类似。该效应无需预处理，即刻发生。
**JAK1/2 inhibition enhances viral gene expression**
时间进程分析显示，Ruxolitinib处理后，E1B55K、E2A、E4orf6/7的mRNA在感染早期（6–8小时）即显著上调，而E1A表达仅在12小时后才轻度增加；蛋白水平验证一致。
**The effect of JAK1/2 inhibition on viral replication requires expression of E1A**
使用E1A缺失病毒dl312和dl70-3，Ruxolitinib对细胞裂解、复制及E2A/E4基因表达的增强效应几乎完全消失，表明E1A是JAK/STAT抑制效应的必需前提。
**The response to Ruxolitinib on viral replication results from enhanced E1B and particularly E4 expression**
过表达E1B55K（XVir-N-5）或E4orf6（XVir-N-6）的病毒本身复制增强4–6倍，但Ruxolitinib处理后复制增强倍数降低（XVir-N-5为3倍，XVir-N-6仅2倍），而XVir03（E1区被CMV-E4orf6-IRES-E1B55K取代）完全无响应，表明E4orf6是下游主要效应基因。
**STAT molecules can contribute in a redundant and phosphorylation-independent mechanism to adenovirus replication**
siRNA敲低STAT1、STAT3、STAT5均使病毒复制增强2–3倍，且Ruxolitinib仍能进一步增效，表明STAT蛋白以冗余且不依赖磷酸化的方式抑制病毒复制。
**Trapping of STAT proteins, using a STAT consensus sequence in the viral genome, improves oncolytic efficacy**
DNA pull-down证实STAT1与STAT-TRAP序列结合，4×多聚体亲和力为单体的3倍。XVir-N-14（含10×STAT-TRAP）在UM-UC-3细胞中复制较XVir-N-31提高11.3倍（24小时），细胞裂解率从25%增至45%，早期基因（E2A、E4orf6）表达在12小时即显著上调，E1A表达不变。
**总结与讨论**
研究人员提出以下模型：E1A与STAT蛋白形成复合物，部分限制E1A对早期病毒启动子的反式激活能力；将STAT诱饵序列插入病毒基因组可隔离STAT蛋白，减少E1A-STAT复合物形成，从而释放更多E1A以激活早期基因转录（图8）。XVir-N-14的复制增强效果弱于药物抑制剂，可能因早期病毒基因组拷贝数有限，限制了STAT结合位点的数量。尽管如此，该方法避免了药物毒副作用，为改良溶瘤病毒提供了新方向，并可扩展至其他抗病毒转录因子的隔离策略。由于许多临床溶瘤腺病毒（如DNX-2401、ONYX-015、CG0070、LOAd703）均依赖E1A驱动的复制程序，该IFN/STAT调控机制具有广泛适用性。
**研究结论（翻译原文结论部分）**
“Together, we demonstrate that inhibition of JAK/STAT signaling results in improved replication and an almost twofold increase in cell lysis, using derivatives of adenovirus type 5. This effect requires E1A as an essential factor, which has been described as a crucial transactivator of E2 and E4 transcription.”
译文：综上所述，研究人员证明，使用5型腺病毒衍生物，抑制JAK/STAT信号会导致复制改善和细胞裂解几乎增加两倍。该效应需要E1A作为必需因子，而E1A已被描述为E2和E4转录的关键反式激活因子。
