《Green Analytical Chemistry》：Quality by Design-Assisted Development and Validation of a Sustainable LC–MS/MS Method for Simultaneous Quantification of Berahyaluronidase Alfa and Pembrolizumab in Rat Plasma: Pharmacokinetic Application and Comprehensive Greenness Assessment
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研究人员开发并验证了一种灵敏、稳健、环境友好的液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时定量大鼠血浆中的贝拉透明质酸酶α（berahyaluronidase alfa）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）。方法开发采用基于质量源于设计（Qua
研究人员开发并验证了一种灵敏、稳健、环境友好的液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）方法，用于同时定量大鼠血浆中的贝拉透明质酸酶α（berahyaluronidase alfa）和帕博利珠单抗（pembrolizumab）。方法开发采用基于质量源于设计（Quality by Design, QbD）的策略，包括风险评估、实验设计和多变量优化，以建立可靠的分析设计空间。使用田口（Taguchi）筛选和Box–Behnken设计方法系统优化了关键色谱参数，包括有机相组成、流动相pH和流速。采用苯基-己基色谱柱结合AB SCIEX QTRAP? 5500质谱仪，在正电喷雾电离模式下实现色谱分离。在选定反应监测模式下进行定量分析，使用m/z 49.52→36.00（贝拉透明质酸酶α）和m/z 146.68→70.01（帕博利珠单抗）的离子对，并以amivantamab作为内标。该方法在贝拉透明质酸酶α 5–200 ng/mL和帕博利珠单抗8.25–330 ng/mL的浓度范围内表现出优异的线性，相关系数大于0.999。贝拉透明质酸酶α的检测限和定量限分别为1.35和4.10 ng/mL，帕博利珠单抗分别为2.58和7.80 ng/mL。验证研究显示，该方法在选择性、准确度、精密度、回收率、基质耐受性、残留控制及稳定性方面均符合国际协调理事会（ICH）M10指南的要求。经验证的方法成功应用于Wistar大鼠的药代动力学研究，贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗的C_max值分别为96.075和155.211 ng/mL，消除半衰期分别为15.0和20.0小时。使用Analytical GREEnness（AGREE）、AGREEprep、Analytical Eco-Scale、碳足迹减少指数（CaFRI）、点击分析化学指数（CACI）、复杂绿色分析程序指数（ComplexGAPI）和复杂改良绿色分析程序指数（ComplexMOGAPI）以及蓝色适用性等级指数（BAGI）进行可持续性评估，确认了所提出分析程序在环境友好性和实用性方面的优势。
**论文解读：基于QbD策略的可持续LC-MS/MS方法开发及其在贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗同时定量中的应用与综合绿色评估**
**研究背景与问题**
帕博利珠单抗（pembrolizumab）是一种靶向程序性死亡受体-1（PD-1）的人源化单克隆抗体，通过阻断PD-1与配体PD-L1/PD-L2的相互作用，恢复T细胞介导的抗肿瘤免疫应答，在多种癌症治疗中广泛应用。贝拉透明质酸酶α（berahyaluronidase alfa）是一种重组人透明质酸酶，可暂时降解皮下组织细胞外基质中的透明质酸，增加组织通透性，促进共给药药物的分散和吸收。两者联合使用可实现皮下给药，缩短给药时间，提高治疗可及性。然而，随着该联合治疗在临床前和临床中的应用扩展，对其系统性暴露、体内处置行为及潜在药理学相互作用进行全面的药代动力学（PK）表征变得至关重要。目前，用于同时定量大鼠血浆中这两种生物治疗药物的分析方法十分有限，亟需开发一种灵敏、可靠、可重复的生物分析平台。传统的免疫分析方法（如ELISA）存在特异性有限、交叉反应、动态范围窄及样品处理流程长等问题。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术因其高灵敏度、高选择性和高重现性，已成为生物基质中药物定量的有力工具。此外，随着绿色分析化学（GAC）原则的推广，在方法开发中需兼顾环境可持续性，减少溶剂消耗、能耗和废物产生。
**研究内容与结论**
本研究旨在开发并验证一种基于分析质量源于设计（AQbD）策略、可持续的LC-MS/MS方法，用于同时定量大鼠血浆中的贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗。通过系统性的方法开发、验证、绿色评估及药代动力学应用，研究团队建立了性能可靠、环境友好的分析平台。该研究首次将AQbD驱动的方法开发策略与全面的绿色评估及药代动力学应用相结合，实现了这两种生物治疗药物的同时测定。论文发表在《Green Analytical Chemistry》。
**主要关键技术方法**
1. **基于质量源于设计（QbD）的方法开发策略**：包括定义分析目标概况（ATP）、进行质量风险评估（使用鱼骨图分析和失效模式与影响分析FMEA）、采用田口（Taguchi）L8正交设计筛选关键方法参数（CMPs），以及使用Box–Behnken设计（BBD）进行多变量优化，以建立分析设计空间。所有实验设计均使用Design-Expert?软件进行。
2. **液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析**：采用Waters Alliance e2695高效液相色谱系统，在Waters Luna Phenyl-Hexyl色谱柱上进行等度洗脱分离。质谱检测使用AB SCIEX QTRAP? 5500三重四极杆质谱仪，在正电喷雾电离（ESI
+）模式下，通过选定反应监测（SRM）模式进行定量。
3. **样品前处理**：采用甲醇进行简单的蛋白沉淀（PPT）法提取血浆中的分析物。
4. **综合绿色评估工具**：使用AGREE、AGREEprep、Analytical Eco-Scale、碳足迹减少指数（CaFRI）、点击分析化学指数（CACI）、复杂绿色分析程序指数（ComplexGAPI）、复杂改良绿色分析程序指数（ComplexMOGAPI）和蓝色适用性等级指数（BAGI）等八种工具对方法的环保性、碳效率、实用性和分析性能进行多维评估。样本来源为健康成年雄性Wistar大鼠。
**研究结果**
**3.1. QbD-Based LC–MS/MS Method Development**
通过风险分析，确定了流动相组成、pH、流速、色谱柱化学性质、柱温、进样体积和质谱采集参数为关键方法参数（CMPs）。田口L8设计筛选表明，有机溶剂比例、流动相酸度和流速是影响方法性能的主要因素。Box–Behnken设计（BBD）优化后，确定了最佳色谱条件：40%有机相、1.0 mL/min流速、pH 2.5。在该条件下，验证实验的预测值与实验值吻合良好，色谱峰形良好、对称且分辨率充分。
**3.2. Mass Spectrometric Optimization and Quantitative Detection**
在正电喷雾电离（ESI
+）模式下，优化了质谱参数。贝拉透明质酸酶α的优化离子对为m/z 49.52→36.00，帕博利珠单抗为m/z 146.68→70.01，内标为m/z 145.90→80.28。该方法实现了高信噪比，无显著内源性干扰。
**3.3. LC–MS/MS Method Validation in Rat Plasma**
方法验证符合ICH M10指南。系统适用性良好，变异系数低于2%。选择性合格，无内源性干扰。贝拉透明质酸酶α在5–200 ng/mL、帕博利珠单抗在8.25–330 ng/mL浓度范围内线性关系优异，相关系数（R2）分别为0.9997和0.9998。灵敏度高，贝拉透明质酸酶α的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为1.35和4.10 ng/mL，帕博利珠单抗的LOD和LOQ分别为2.58和7.80 ng/mL。基质效应可忽略（基质因子在96.16%-98.54%之间，CV<2%）。四水平质控样品的准确度（回收率）和精密度（CV）均符合标准，贝拉透明质酸酶α回收率92.76%-98.06%，CV 0.36%-1.96%；帕博利珠单抗回收率94.48%-98.28%，CV 0.18%-1.58%。残留效应可忽略（
在稳定性研究中，贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗在室温6小时、-70°C三次冻融、自动进样器（10°C）24小时、干/湿提取物24小时以及-80°C短期储存（2天）条件下均保持稳定。长期储存（-80°C，30天）后，回收率略有下降，但仍在可接受范围内。
**3.4. Pharmacokinetic Evaluation in Rats**
该方法成功应用于Wistar大鼠单次给药（贝拉透明质酸酶α 0.002 mg/kg，帕博利珠单抗 0.003 mg/kg）后的药代动力学研究。帕博利珠单抗的C_max为155.211 ng/mL，T_max为1.0 h；贝拉透明质酸酶α的C_max为96.075 ng/mL，T_max为2.0 h。帕博利珠单抗的全身暴露量（AUC
0–t = 9573 ng·h/mL）远高于贝拉透明质酸酶α（488 ng·h/mL）。帕博利珠单抗的消除半衰期（t
1/2 = 20.0 h）长于贝拉透明质酸酶α（15.0 h）。该方法准确表征了两种分析物的完整血浆浓度-时间曲线。
**3.5. Assessment of Method Greenness and Practicality**
综合绿色评估结果显示，该方法环境友好、实用性强。ComplexGAPI图谱显示整个过程主要为绿色和黄色区域，表明环境可接受。AGREE得分为0.69，符合GAC原则。AGREEprep得分为0.66。Analytical Eco-Scale得分为74，属于可接受环境级别。CaFRI得分为78，表明有效降低了碳足迹。CACI得分为81，表明在环境兼容性、分析性能和操作简便性之间取得了良好平衡。ComplexMOGAPI得分为81，综合环境表现优异。BAGI得分为75.0，表明该方法具有高度的操作可行性、分析可靠性、成本效益和常规实验室适用性。
**结论讨论与翻译**
**讨论部分总结：** 该研究成功开发并验证了一种稳健、灵敏且可持续的AQbD辅助LC-MS/MS方法，用于同时定量大鼠血浆中的贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗。通过系统性的方法开发（包括风险评估、筛选和优化），获得了可靠、可重复的分析方法，色谱性能优异。全面的方法验证结果完全符合ICH M10指南。药代动力学应用成功表征了两种分析物的体内处置特征。多维度的可持续性评估证实，该方法在分析性能、环境可持续性和操作实用性之间达到了最佳平衡。该研究是首个将AQbD驱动的LC-MS/MS方法与全面绿色评估相结合，用于同时测定这两种生物治疗药物的研究。
**结论翻译：** 成功开发并验证了一种稳健、灵敏且可持续的AQbD辅助LC-MS/MS方法，用于同时定量大鼠血浆中的贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗。利用风险评估、田口筛选和Box–Behnken设计进行系统性的方法开发，能够识别和优化关键分析变量，从而获得一个具有优异色谱性能、可靠且可重复的分析方法。经验证的方法表现出卓越的选择性、线性、灵敏度、精密度、准确度、回收率、基质效应和稳定性，完全符合ICH M10生物分析方法验证指南。该方法在Wistar大鼠药代动力学研究中的成功应用，证明了其适用于准确表征两种分析物的体内处置。此外，使用AGREE、AGREEprep、Analytical Eco-Scale、CaFRI、CACI、ComplexGAPI、ComplexMOGAPI和BAGI进行的全面可持续性评估证实，该方法在分析性能、环境可持续性和操作实用性之间达到了最佳平衡。据研究人员所知，这是首个将AQbD驱动的LC-MS/MS方法与全面绿色评估相结合，用于同时测定大鼠血浆中贝拉透明质酸酶α和帕博利珠单抗的研究。所提出的方法不仅为常规药代动力学、毒代动力学和临床前生物分析研究提供了一个可靠的分析平台，还支持了药物研究中可持续分析实践的日益推广。系统性的AQbD优化、全面的绿色评估和成功的药代动力学应用的整合，突显了该开发方法在未来的生物分析和转化研究中的科学意义和实用价值。
