氧化应激诱导大肠杆菌aryl polyene表达，致敏细菌应激反应并调节先天免疫细胞的氧化还原环境

《Microbiology Spectrum》：Oxidative stress induces E. coli aryl polyene expression, sensitizing the bacterial stress response and modulating the redox environment of innate immune cells

　　

芳基多烯（Aryl polyenes, APEs）是专门化的多不饱和外膜脂质，可保护其生产者免受氧化应激并促进生物膜形成。APEs由一种在革兰氏阴性菌分支中保守的丰富生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）家族产生。APE生物合成途径涉及11种不同酶，最终将APEs连接到革兰氏阴性菌外膜的一个锚定分子上。与大多数其他小分子BGC不同，APE BGC不包含一个专门的调控基因来控制其代谢高成本化合物的产生。基于研究人员先前对APEs在急性氧化应激保护中作用的观察，研究人员使用尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic Escherichia coli, UPEC）菌株证明，APE表达赋予了一种潜在的竞争优势，其特征为早期生长增强、细菌氧化应激反应致敏以及体外感染后先天免疫细胞氧化还原应激的减弱。研究人员的数据表明，APEs可作为UPEC的适应性因子，在未来的工作中，研究人员旨在研究它们对总体细菌致病性和生存的贡献，以及APEs如何促进从贫氧环境（如肠道）到富氧环境（如尿道）的过渡。重要性：细菌病原体利用多种机制在恶劣条件下（如与宿主相互作用时）获得竞争优势。研究人员研究了芳基多烯（APEs）——在外膜中的专门化多不饱和脂肪酸——在尿路致病性大肠杆菌菌株背景下的功能。APE表达由氧化环境诱导，并有助于早期生长和氧化应激反应的致敏。此外，表达APE的大肠杆菌减弱了靶宿主吞噬细胞的细胞内氧化环境。这些发现表明APEs作为适应性因子的作用，并创造了研究其体内功能以及将其作为潜在药物靶点进行探索的机会。

**论文解读：氧化应激诱导大肠杆菌芳基多烯表达，致敏细菌应激反应并调节先天免疫细胞的氧化还原环境**

**研究背景与问题**
活性氧（reactive oxygen species, ROS）和活性氮（reactive nitrogen species, RNS）统称为RNOS，是重要的分子信号分子，对细菌和宿主生存均至关重要。宿主通过多种NADPH氧化酶和次级过氧化物酶（如中性粒细胞髓过氧化物酶）产生RNOS，以预防病原体感染。在细菌中，RNOS信号参与代谢转换，如从厌氧呼吸转变为有氧呼吸。当先天免疫系统大量产生RNOS时，它们作为强效抗菌剂，在微摩尔浓度下存在于人尿液中，并在脓毒症患者的血液和尿液中显著升高。高水平的RNOS对微生物组施加选择压力，为适应性增强的细菌提供机会以超越其他群落成员，导致菌群失调及相关病理。为应对剧烈的氧化还原变化，细菌进化出多种调节和淬灭机制，包括生物膜形成和细胞包膜保护性代谢物表达。芳基多烯（aryl polyene, APE）生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster, BGC）在革兰氏阴性菌中广泛分布，包括大多数致病性大肠杆菌（如尿路致病性大肠杆菌（uropathogenic E. coli, UPEC）菌株CFT073）。APEs是黄色素羧酸，由芳基头基和共轭双键系统组成，酰化至细菌外膜中的较大脂质上，结构上与革兰氏阳性菌中的色素化毒力因子相似。然而，APE BGC通常不包含专门的调控基因，目前尚不清楚何种调控级联控制APE基因表达，以及细菌氧化还原防御如何与APE存在协同作用。鉴于APE BGC存在于多种模型病原体和共生菌中，其参与微生物-宿主相互作用可从文献挖掘中推断。例如，转录组分析鉴定出APE BGC基因在人类尿路感染期间作为诱导适应性因子。因此，有必要研究APE在氧化应激下的表达调控及其对宿主免疫细胞的影响。

**研究内容与结论**
研究人员使用重组大肠杆菌TOP10（缺乏内源性APE BGC的K-12衍生菌株）和UPEC菌株CFT073，证明APE表达在体外氧化应激条件下赋予早期生长优势，致敏细菌氧化应激反应，并减弱先天免疫细胞的氧化还原应激。研究表明，APEs可能作为UPEC的适应性因子，在宿主-病原体相互作用中提供多角度保护。该论文发表在《Microbiology Spectrum》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用以下关键方法：生长动力学分析（通过测量OD₆₀₀监测细菌生长）、细胞脂质提取及氧化漂白试验（通过测量441 nm吸光度评估APE色素氧化）、实时定量PCR（qPCR）分析基因表达（使用2^???CT法，以adk为内参基因）、流式细胞术检测CellROX（用于ROS定量）和髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）表达（使用小鼠RAW 264.7巨噬细胞样细胞和原代人中性粒细胞）。样本来源：RAW 264.7细胞系和从白膜层分离的原代人中性粒细胞。

**研究结果**

**APE表达赋予大肠杆菌在氧化应激下的早期生长优势**
通过比较TOP10^APE+（异源表达APE BGC）与TOP10^EV（空载体对照）的生长曲线，研究人员发现慢性暴露于1 mM H₂O₂导致TOP10^EV生长缺陷（倍增时间增加2倍），而TOP10^APE+未出现类似缺陷，表明APEs在早期生长阶段提供保护。相反，在超氧化物和NO生成剂SIN-1暴露下未观察到显著生长优势。

**RNOS暴露减少APE色素沉着**
对TOP10^APE+细胞包膜进行脂质提取，暴露于3 M H₂O₂或SIN-1后，监测441 nm处吸光度下降，表明APE色素随时间被氧化漂白，提示APEs可能作为RNOS的牺牲性清除剂。

**氧化压力诱导APE基因表达并致敏大肠杆菌CFT073的氧化应激反应**
在UPEC菌株CFT073中，CFT073^APE+（组成型表达APE）在H₂O₂暴露下表现出更短的迟滞期和更高的存活率。qPCR分析显示，慢性H₂O₂暴露24 h后，APE BGC基因（如apeO、apeD）表达上调，但急性暴露15 min后未观察到上调。然而，在CFT073^APE+中，H₂O₂暴露15 min后，oxyR（H₂O₂诱导操纵子的传感器和正调控因子）、下游小非编码调控RNA oxyS以及过氧化氢酶-过氧化物酶katG的mRNA水平显著升高，而CFT073^EV中未观察到，表明APE表达致敏了oxyR依赖性应激反应。

**受大肠杆菌CFT073^APE+感染的吞噬细胞具有减弱的氧化应激反应**
以10:1的多重感染复数感染小鼠RAW 264.7细胞，流式细胞术检测CellROX染色显示，感染CFT073^APE+的细胞中ROS阳性细胞比例比感染CFT073^EV或CFT073^KO（APE敲除）的细胞减少约4倍。类似地，在原代人中性粒细胞中，感染CFT073^APE+的细胞中表达MPO的中性粒细胞比例降低，且MPO中位荧光强度也低于其他对照组。这表明APE表达可削弱宿主吞噬细胞产生RNOS的能力。

**总结与讨论**
研究人员总结认为，APE表达在RNOS选择性压力下赋予大肠杆菌早期对数期生长优势，这种优势可能有助于抵消指数生长期间呼吸能量产生增加所致的氧化损伤。APE色素被氧化漂白表明其可作为牺牲性清除剂，而APE表达致敏oxyR依赖性应激反应（包括oxyS和katG上调）可能部分解释APE+细胞的生长和存活优势。此外，APE表达细菌体外感染后减弱了小鼠巨噬细胞和人中性粒细胞的氧化应激和MPO活性。因此，APE提供了一种多角度保护策略：直接保护、促进快速抗氧化表达以及削弱宿主细胞RNOS产生。这些发现暗示APE产生者在宿主-病原体相互作用中具有潜在的生存优势，并可能解释为何许多致病性革兰氏阴性菌保留了APE BGC。未来研究将探讨APE表达在宿主-病原体相互作用中的生理意义，并确定其是否导致病理增强。研究结论部分翻译如下：综合来看，研究人员的结果表明，APEs可作为携带该BGC的革兰氏阴性菌的适应性因子。