播散性、泌尿生殖道及直肠感染的淋病奈瑟菌菌株的基因组分析揭示铁获取及IV型分泌系统相关基因的差异

《Microbiology Spectrum》：Genomic analysis of Neisseria gonorrhoeae strains from disseminated, urogenital, and rectal infections reveals differences in genes for iron acquisition and type IV secretion

　　

淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)是一种专性人类病原体，可引起性传播感染淋病。延误治疗或免疫功能低下可能导致播散性淋球菌感染(DGI)的风险增加，此时感染会蔓延至通常无菌的解剖部位，包括血流。淋球菌产生TonB依赖性转运蛋白将其翻译为TdT，以从宿主营养免疫蛋白中螯合金属。这些转运蛋白对细菌生存至关重要，是重要的毒力因子。研究人员表征了来自播散性(n = 47)、泌尿生殖道(n = 86)和直肠(n = 12)感染的菌株基因组中受铁调节的TdT编码基因。研究发现，与泌尿生殖道或直肠感染菌株相比，从DGI感染中分离的淋球菌菌株更有可能表达功能性的血红蛋白-铁利用操纵子(hpuAB野生型且相位开启 [32%, n = 15/47])，在tdfF中携带无义突变(57%, n = 27/47)，且被预测表达低水平的fetA(43%, n = 20/47)。相比之下，来自局灶性泌尿生殖道感染的淋球菌菌株与更高频率的功能性tdfF基因(66%, n = 57/86)和高fetA表达(30%, n = 26/86)相关。此外，直肠感染菌株更常被发现具有高fetA表达(33%, n = 4/12)和功能性tdfF(75%, n = 9/12)。此外，研究人员还发现了tdfF的存在与缺失与编码IV型分泌系统(T4SS)的淋球菌遗传岛(GGI)之间存在关联。这些发现为研究人员对播散性淋球菌感染潜在分子机制的不断深入理解提供了信息。

淋病是由专性人类病原体淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae, Ngo)引起的性传播感染，是全球日益严重的公共卫生威胁。随着抗菌药物耐药性的上升且尚无获批的预防性疫苗，淋病的治疗面临着巨大挑战。通常泌尿生殖道感染表现为尿道炎或宫颈炎，但在延误诊断、宿主免疫缺陷或补体抑制药物的作用下，感染可能进展并蔓延至血液等无菌解剖部位，导致播散性淋球菌感染(DGI)。近年来DGI发病率上升，促使研究人员深入探究其遗传基础。细菌在侵入宿主时需克服营养免疫造成的金属限制，Ngo通过产生TonB依赖性转运蛋白从宿主蛋白中螯合铁以维持生存和毒力。鉴于铁代谢在侵袭性疾病中的重要作用，探讨不同感染部位的菌株是否具有特定的基因型谱以促进生态位适应具有重要意义。该研究成果已发表在《Microbiology Spectrum》期刊上。

研究人员为开展研究主要使用了以下关键技术方法：获取了来自美国和加拿大2013至2020年间的临床分离株全基因组测序数据队列，包含播散性(n = 47)、泌尿生殖道(n = 86)及直肠(n = 12)感染菌株。通过多序列比对和最大似然法构建系统发育树分析基因多样性；利用PubMLST数据库中的Ng cgMLST v2方案（包含1,430个核心基因）进行核心基因组多位点序列分型并确定生命识别码(LIN)；通过序列映射分析淋球菌遗传岛(GGI)的存在及其超级集群分类；最后使用Fisher精确检验及Bonferroni校正进行统计学差异分析。

研究得到以下结果：

WHO参考菌株中独特tdfF等位基因的鉴定
通过分析实验室及参考菌株的基因组序列，研究人员在三个WHO参考菌株中检测到tdfF缺失突变。翻译后的氨基酸序列预测显示这些缺失会导致过早的内部终止密码子，从而产生截短的、无功能的TdfF。

铁获取基因中观察到生态位特异性差异
对2013至2020年全基因组序列分析发现，tdfF基因的插入/缺失(indels)导致的缺失突变最常与DGI Ngo菌株相关(57%, n = 27/47)。而功能性tdfF⁺在泌尿生殖道(66%)和直肠(75%)菌株基因组中更为普遍。此外，确认了tdfG1和tdfG2两个变体，其中tdfG1在所有三种分离群体中占据主导地位，尤其是在直肠感染菌株中达到100%。

相变异对生态位适应性铁获取的贡献
fetA基因启动子区的多聚胞嘧啶(poly-C)片段长度可调节其转录水平。DGI菌株显示出更高频率的低表达fetA等位基因(43%)，而对应高fetA表达的等位基因在直肠(33%)和泌尿生殖道(30%)菌株中检测更为频繁。在lbpBA系统方面，仅有一小部分菌群存在野生型且相位开启的lbpBA操纵子。对于hpuAB系统，大多数菌株的hpuA基因存在移码突变而功能关闭，但在DGI菌株中，hpuAB为野生型且相位开启的频率(32%, n = 15/47)显著高于泌尿生殖道(15%)和直肠菌株(0%)。

DGI、泌尿生殖道和直肠Ngo的种群结构
系统发育分析显示，大多数菌株具有独特的LIN码，表明它们并非克隆群。仅有小部分DGI、泌尿生殖道和直肠菌株聚集在不同的克隆群中。

tdfF系统发育及生态位相关突变
tdfF等位基因在不同菌株中具有高度核苷酸序列同源性(98%-100%)。但在DGI菌株中观察到了特定的高频突变，主要为tdfF?308–317、tdfF?1,245–1,254及双重缺失突变，导致超过一半的DGI菌株群体携带产生提前终止密码子的tdfF等位基因，截断了TdfF蛋白。

GGI位点存在与tdfF等位基因之间的关联
研究发现tdfF与GGI的存在之间存在显著的统计学关联。功能性tdfF⁺与GGI⁺的共发在直肠菌株中较频繁。而非功能性tdfF等位基因与GGI⁺的共发在DGI菌株中频繁出现(49%, n = 23/47)。

GGI超级集群A1和A2与tdfF等位基因的共发
GGI被分为A1、A2和B三个超级集群。在具备GGI的DGI菌株中，携带非功能性tdfF等位基因的菌株仅与能够分泌DNA的T4SS相关联，即超级集群A1和A2。此外，在直肠菌株中更常观察到tdfF⁺与GGI超级集群A2的共发关联。

泌尿生殖道菌株中基因型分布的性别差异
由于男女泌尿生殖道代表显著不同的生态位，比较基因组发现两者在tdfF和tdfG基因上存在统计学差异。男性尿道样本具有更高频率的完整tdfF⁺等位基因和更高比例的tdfG2等位基因。

在讨论部分，研究人员总结指出，为了建立感染，Ngo必须克服宿主免疫反应、金属限制和环境压力。选择压力驱动细菌发生移码突变，从而促进宿主适应和免疫逃避。相变异是常见的逃避策略，允许基因表达的可逆开启/关闭。研究表明，不同的铁运输机制可能在播散性、泌尿生殖道和直肠感染中被差异性选择。HpuAB、LbpBA、FetA、TdfG1和TdfF的表达可能与生态位适应相关，这些营养获取蛋白编码基因中频繁发生的遗传变异为不同解剖部位的感染提供了差异化益处。

研究结论表明，虽然引起DGI的Ngo菌株并未获得具有已知播散性疾病贡献的特异性基因，但在被铁调节的TdT蛋白中存在明显的相变异和等位基因变异。TdfF编码基因中频繁出现的突变等位基因常在具有功能性GGI的播散性Ngo菌株中被鉴定出。该研究首次将Ngo部署的铁获取策略与疾病表现及生态位适应相关联，揭示了TdfF和编码T4SS的GGI超级集群在侵袭性感染中具有补偿性功能，这为探究严重淋球菌疾病保守抗原及制定新的治疗和预防策略提供了重要的分子基础。