《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：BmOrb2, a CPEB-family RNA-binding protein, specifically regulates late-stage eupyrene spermiogenesis and male fertility in
Bombyx mori
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•BmOrb2主要在家蚕的睾丸中表达，具体存在于精原细胞以及处于早期伸长阶段的带核精子中，而在晚期带核精子和无核精子中则不存在。•Bmorb2的缺失会严重扰乱带核精子的生成过程，尤其是在伸长阶段，从而导致精子核定位异常、鞭毛缩短、精子无法正常移向精巢，最终引发雄性不育。•Bmor
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BmOrb2主要在家蚕的睾丸中表达，具体存在于精原细胞以及处于早期伸长阶段的带核精子中，而在晚期带核精子和无核精子中则不存在。
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Bmorb2的缺失会严重扰乱带核精子的生成过程，尤其是在伸长阶段，从而导致精子核定位异常、鞭毛缩短、精子无法正常移向精巢，最终引发雄性不育。
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Bmorb2突变体中的精子生成缺陷与能量代谢紊乱、染色质重塑功能受损以及运动蛋白和IFT复合体的组装失调有关。
引言
精子生成是一个高度有序的过程，其中精原干细胞经过分化形成具有功能的精子（Subash等人，2021）。这一复杂而有序的转变经历三个关键阶段：（i）有丝分裂增殖阶段，此时精原干细胞分化为初级精母细胞；（ii）减数分裂阶段，通过两次连续分裂产生单倍体的圆形精细胞；（iii）精子发生阶段，即精细胞经历大规模的形态重构和染色质凝缩，最终形成成熟的、具有物种特异性的精子。在复杂的精子生成过程中，转录后调控，尤其是mRNA的翻译调控，起着不可替代的作用（Morgan等人，2021）。作为这一调控网络中的关键节点，RNA结合蛋白通过结合目标mRNA中的特定调控元件，精确控制精子生成过程中基因表达的时机（Li, Y等人，2024）。
细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白家族是一组序列特异性RNA结合蛋白，从无脊椎动物到脊椎动物都存在高度保守性（Gilmutdinov等人，2019）。这类蛋白通过识别目标mRNA 3'非翻译区内的细胞质多聚腺苷酸化元件，进而调节多聚(A)尾的长度，从而控制翻译过程。自四十多年前在非洲爪蟾卵母细胞中发现以来，CPEB介导的翻译调控已被证实参与多种重要生物过程的调控，包括胚胎细胞分裂、细胞衰老、p53基因表达调控、突触可塑性以及长期记忆的形成（Huang等人，2023；Hicks等人，2025）。在生殖系统中，这种调控功能尤为重要，它在精子生成过程中发挥着关键作用（Gilmutdinov等人，2019）。不同物种的CPEB基因数量存在显著差异：人类、小鼠和秀丽隐杆线虫各有四个该基因，而黑腹果蝇仅有两个成员，即orb和orb2。其中，orb主要参与雌性生殖细胞的卵室发育，在精子生成的最后阶段以及黑腹果蝇大脑中某些蘑菇体神经元中也有低水平表达（Barr等人，2019）。相比之下，orb2主要参与精子生成和体细胞发育，其表达模式具有明显的时间特异性（Santana等人，2017；Stewart等人，2023）。在减数分裂开始时，orb2的表达水平会显著上升，这与它在生殖系干细胞以及精子生成早期阶段的低表达水平形成对比（Stepien等人，2016）。在精细胞分化过程中，尤其是在鞭毛轴丝伸长阶段，Orb2会定位于细胞质中，并形成特有的“彗星尾”结构，参与调控轴丝的生长以及个体化复合体的形成（Stepien等人，2016）。对黑腹果蝇orb2突变体的研究表明，该基因不仅对正常的减数分裂进程至关重要，也对精子生成的多个关键步骤起着重要作用，包括精细胞极化、鞭毛轴丝伸长以及精细胞个体化（Gilmutdinov等人，2021；Low等人，2026）。虽然orb2在黑腹果蝇精子生成中的作用已得到充分研究，但其在家蚕中的同源基因是否也参与类似的发育过程目前尚不清楚。鉴于家蚕作为鳞翅目模式昆虫在农业上的重要性，填补这一知识空白不仅能揭示翻译调控的保守机制，还能为了解昆虫中CPEB家族功能的进化差异提供重要依据。
尽管不同物种的精子生成基本阶段大致相似，但其背后的分子和细胞机制却存在很大差异。家蚕作为重要的经济昆虫及鳞翅目模式生物，具有典型的双型精子生成机制，能够同时产生带核精子和无核精子（Chen等人，2019；Zhang等人，2024；Chen等人，2025）。这两种类型的精子对雄性的生育能力都至关重要。带核精子能够像其他物种的普通精子一样使卵子受精，而无核精子则在辅助受精过程中发挥重要作用（Chen等人，2020）。然而，调控双型精子形成的分子机制目前仍不十分清楚。带核精子和无核精子生成是如何协同调控的，也几乎尚未被阐明。特别是决定精子命运分化的信号通路和关键因子也尚未明确。由于Orb2在黑腹果蝇精子生成的关键步骤中起调控作用，因此很有兴趣探讨类似的翻译调控机制是否也参与了家蚕双型精子的形成（Gilmutdinov等人，2021）。
在本研究中，我们证明了家蚕中的orb2同源基因Bmorb2在维持雄性生育能力方面起着不可或缺的作用，它通过调控带核精子的形成来发挥作用。Bmorb2在睾丸中具有特异性表达，主要存在于精原细胞以及带核精子的早期发育阶段。通过构建Bmorb2突变体，我们发现该基因的缺失会特异性地损害带核精子的发育，导致精细胞核定位异常、鞭毛缩短以及精子束形成缺陷，而不会影响无核精子的发育。研究还发现，与精子生成相关的多个通路出现调控紊乱，如组氨酸向精氨酸的转化、动力蛋白的功能、N-糖基化以及脂肪酸代谢途径等。本研究表明，Bmorb2在家蚕双型精子生成过程中发挥着关键的分子作用，为了解昆虫中CPEB家族的功能进化提供了新视角，也为研究鳞翅目昆虫的生殖生物学奠定了重要基础。
章节要点
家蚕品系
本研究的所有实验均使用多代繁殖且不滞育的家蚕品系Nistari进行。幼虫在25℃的标准饲养条件下以新鲜桑叶为食（Tan等人，2013）。
通过CRISPR/Cas9技术构建突变体
按照先前的方法构建了两种质粒，以此建立二元的转基因CRISPR/Cas9系统（Chen等人，2023a）。其中质粒pBac-IE1-EGFP-nos-Cas9在Nanos启动子的控制下表达Cas9核酸酶，而EGFP则由
Bmorb2在精原细胞和带核精子中表达，而非无核精子中
为了了解其功能，我们首先研究了Bmorb2的时空表达模式。通过qRT-PCR检测发现，Bmorb2在多个发育阶段都在睾丸中高表达，这一表达模式在幼虫游动期通过Western blot分析得到了进一步验证（图1A）。时间表达分析显示，从L5D0开始直到幼虫期，睾丸中的Bmorb2 mRNA水平一直保持较高水平，之后逐渐下降
讨论
精子生成是指精原干细胞经过精确调控分化为具有功能成熟精子的过程（Hermann等人，2018）。在家蚕中，带核精子的生成经历三个连续的阶段。首先，精原细胞通过有丝分裂增殖并分化为初级精母细胞；其次，减数分裂产生单倍体的圆形精细胞；最后，在精子发生阶段，圆形精细胞会经历大规模的形态重构，包括
CRediT作者贡献说明
Guo Peilin：撰写——初稿、方法学、研究实施、数据整理、概念设计。Liu Yutong：撰写——初稿、资源获取、项目管理、方法学、研究实施。Kang Hongxia：撰写——初稿、可视化处理、验证、软件应用、资源获取、方法学、研究实施、正式分析、数据整理、概念设计。Chen Kai：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化处理、验证、监督、项目管理，
未引用参考文献
Chen等人，2025；Chen等人，2020；de Rooij和Grootegoed，1998；Friedl?nder等人，2005；Huang等人，2023；Kubota和Brinster，2018；Li等人，2024；Santana和Casas-Tintó，2017；Seth等人，2023；Stewart等人，2024；Subash和Kumar，2021；Tanaka和Baba，2005；Tay和Richter，2001。
数据可用性声明
本研究中的原始数据均已包含在论文中。如有进一步需求，可联系相应作者。本研究中的RNA-seq原始数据已存储在NCBI SRA数据库中，访问编号为PRJNA1447229。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号32472978、32573304）、江苏省自然科学基金（编号BK20250131）以及江苏省研究生科研创新计划（编号KYCX23_3912）的支持。
Hongxia Kang|Yutong Liu|Peilin Guo|Anjiang Tan|Kai Chen
