利用中性蛋白酶Ⅰ和碱性蛋白酶从高度水解的乳清蛋白中提取的血管紧张素转化酶抑制剂、猪胰脂肪酶抑制剂及黄嘌呤氧化酶抑制剂肽

《International Dairy Journal》：Angiotensin-Converting Enzyme, Porcine Pancreatic Lipase, and Xanthine Oxidase inhibitory Peptides derived from Extensively hydrolyzed Whey Proteins Using Neutral Protease Ⅰ and Alkaline Protease

　　

摘要

为提高乳清蛋白的利用率，本研究使用两种蛋白酶——中性蛋白酶Ⅰ（AoNPⅠ）和碱性蛋白酶（MoS8）制备了深度水解乳清蛋白（EHWP）。系统评估了EHWP对血管紧张素转换酶（ACE）、猪胰脂肪酶（PPL）及黄嘌呤氧化酶（XOD）的抑制活性。EHWP主要由低分子量肽组成，其中分子量低于3 kDa的肽占所有肽总量的96.2%。EHWP对这三种酶均表现出较强的抑制作用，其IC₅₀值分别为0.38 ± 0.02、0.53 ± 0.04和11.7 ± 0.22毫克/毫升。通过LC-MS/MS技术鉴定出了三种新的生物活性肽，其中LGPRRWCK的多种抑制活性最为显著，其对ACE、PPL和XOD的IC₅₀值分别为0.024 ± 0.004、0.018 ± 0.002和3.82 ± 0.06毫克/毫升。本研究表明，EHWP是提取生物活性肽的优质来源。

引言

乳清作为酪蛋白生产过程中的副产品，含有大量具有生理功能和生物活性的成分（Li & Zhu, 2024）。乳清蛋白主要由β-乳球蛋白（β-LG）、α-乳白蛋白（α-LA）、免疫球蛋白（IG）和乳铁蛋白（LF）构成（Li & Zhu, 2024）。它们具有多种生物活性，如抗氧化作用、促进生长以及增强免疫反应（Brandelli et al., 2015; Abish et al., 2024; Ge et al., 2024）。此外，乳清蛋白的氨基酸组成十分均衡，尤其是必需氨基酸和支链氨基酸含量丰富（Masotti et al., 2024）。近年来，从蛋白质水解物中获得的生物活性肽因其生理功能及较高的吸收效率而备受关注（Abish et al., 2024）。生物活性肽可通过微生物发酵、酶解、化学合成及重组表达等方法制备（Abish et al., 2024; Ge et al., 2024），其中酶解法因其绿色环保且高效的特点而被广泛采用。蛋白酶在生物活性肽的制备中起着关键作用，它们能够释放出具有生理活性的特定肽段（Li & Zhu, 2024）。先前的研究已表明，通过模拟胃肠道消化从乳清蛋白中得到的肽段具有调节胆固醇的水平的作用（Masotti et al., 2024）。此外，经模拟胃肠道消化处理后的乳清蛋白水解物还能调节运动小鼠的肌肉代谢，从而显著提升碳水化合物代谢物的水平（Zhao et al., 2024）。低分子量肽（< 3 kDa）通常具有较高的生物活性，而深度水解乳清蛋白中超过95%的肽段分子量都低于3 kDa，这类蛋白能够增加短肽的比例，进而便于其被消化并吸收到血液中（Maryniak et al., 2024）。用碱性蛋白酶和中性蛋白酶制备的深度水解酪蛋白被用于婴儿配方奶粉中，以降低过敏反应的风险（Qin et al., 2023）。用碱性蛋白酶处理的深度水解β-乳球蛋白可促进凝胶形成，这一效应源于小分子肽的产生（Dou et al., 2024）。尽管深度水解技术能够释放多种生物活性肽，但EHWP的具体生物活性及其抑制机制目前仍不甚清楚。因此，亟需对EHWP的生物活性展开深入研究，不仅是为了填补现有知识空白，也为开发具有更高营养价值和生物活性的乳清基产品提供理论依据。

近年来，从蛋白质水解物中分离得到的血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽受到了广泛关注（Du et al., 2024）。在不同的蛋白水解条件下，人们已从乳清蛋白水解物中分离出了多种ACE抑制肽（Du et al., 2024; Li et al., 2022）。这类ACE抑制肽通常由2-20个氨基酸残基组成，且往往富含 IW、WL、ALPMHIR等疏水性和芳香族氨基酸（Xue et al., 2021; Faucher et al., 2022）。这些研究结果有助于了解特定氨基酸残基在生物活性中的作用，为筛选高效的ACE抑制肽提供了思路。猪胰脂肪酶（PPL）抑制肽也被视为治疗肥胖的有效手段，与合成药物相比，它的安全性更高（Wang et al., 2025; Zhang et al., 2021）。PPL抑制肽可通过多种途径调节肥胖，包括调控脂肪生成、能量代谢以及食欲控制（Suryaningtyas & Je, 2023; Suryaningtyas et al., 2025）。已有研究证明，PIISVYWK和FSVVPSPK等PPL抑制肽能够减轻与肥胖相关的炎症和氧化应激反应（Baba et al., 2021）。最近还有研究从骆驼乳清蛋白水解物中发现了两种新的PPL抑制肽（MLPLMLPFTMGY和LRFPL），这两种肽可通过多个残基及底物结合位点与PPL结合，显示出良好的抑制效果（Baba et al., 2021）。

血液中尿酸水平升高会增加高尿酸血症、痛风、高血压及糖尿病的发病风险（Li et al., 2025）。黄嘌呤氧化酶（XOD）是嘌呤代谢中的关键酶，它负责催化次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，继而进一步转化为尿酸（Qi et al., 2022）。XOD抑制肽可从乳清、大米蛋白及鱼蛋白水解物等多种来源中获取（Wang et al., 2024; Bu et al., 2020）。在乳清蛋白分离物经过模拟胃肠道消化后产生的PEW和LLW两种肽，能够显著抑制XOD的活性（Qi et al., 2022）。分子对接研究进一步阐明了其抑制机制，表明这些肽可以通过阻止底物与XOD结合，同时引起酶活性位点的构象变化，从而发挥抑制作用（Hu et al., 2021; Hao et al., 2024）。

本研究旨在探讨利用AoNPⅠ（Ke et al., 2012）和MoS8（Xue et al., 2025）组成的双酶体系来制备EHWP的方法。选择这两种蛋白酶是因为它们对芳香族酸、疏水性氨基酸以及极性氨基酸具有不同的水解特异性。目前对于不同蛋白酶体系及水解条件如何影响水解产物的肽谱、生物活性及功能特性的机制，仍缺乏深入的了解。首先，通过单因素实验和响应面分析法优化了水解条件。随后，利用超滤和凝胶色谱技术分离出具有不同分子量分布的肽段，并检测了它们对ACE、PPL和XOD的抑制活性。最后，鉴定出了新的生物活性肽，并通过固相肽合成技术将其合成出来，随后再次检测了它们的抑制活性。通过以上研究，本文系统地研究了EHWP制备过程的优化方法，并全面评估了其生物功能特性，旨在为开发可用于功能性食品的生物活性乳清蛋白成分提供理论依据和技术支持。

章节要点

材料与试剂

含80.0%蛋白质的乳清蛋白购自北京银河路科技有限公司。ACE、XOD、PPL、对硝基苯丁酸（P-NPB）、Hippuryl-His-Leu（HHL）以及黄嘌呤氧化酶均购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma公司。来自米曲霉的中性蛋白酶I（AoNPⅠ，活性为1.5×10⁴ U/毫升，作用pH范围为7-9，适宜温度为45-55°C）（Ke et al., 2012）以及来自紫红曲霉的类枯草菌丝氨酸蛋白酶（MoS8，活性为5.2×10³ U/毫升，作用pH范围为7-10，适宜温度为40-50°C）（Xue et al., 2025）则由本研究自行制备

EHWP制备过程中的单因素实验与响应面分析法实验

如图1、图2所示，本研究分别开展了单一酶水解实验和双酶水解实验。使用AoNPI水解乳清蛋白时，蛋白质的回收率从54.5%上升至60.6%，DH值从20.6%上升至23.7%，分子量低于3 kDa的肽段占比则在42.3%到86.3%之间变化。而用MoS8水解乳清蛋白时，蛋白质回收率从57.8%上升至62.7%，DH值从20.7%上升至28.3%，

结论

本研究成功利用AoNPⅠ和MoS8两种蛋白酶制备出了EHWP，该蛋白中超过95%的肽段分子量低于3 kDa。分子量低于3 kDa的肽段以及F4组分对ACE、PPL和XOD的抑制活性尤为突出。本研究还鉴定出了三种新的肽段——LGPRRWCK、QDKIHPF和FMGPQCE，这些肽段可通过氢键、疏水相互作用以及静电相互作用与ACE、PPL和XOD强烈结合。这些研究结果充分表明，EHWP具有较高的生物活性

CRediT作者贡献说明

：撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供。颜希民：撰写——初稿撰写、方法设计、实验开展、数据分析。韩东：可视化处理、方法设计。薛一斌：可视化处理。卢福平：实验开展、数据分析。颜巧娟：撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供、资金筹集。蒋正强：撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供

未引用参考文献

Huang et al., 2025; Ketprayoon et al., 2021; Kim and Lim, 2020; Qi et al., 2022; Wang et al., 2025.

利益冲突声明

作者们不存在任何利益冲突。

数据可用性

相关数据可在提出请求后提供。

利益冲突声明

作者们声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金的支持（项目编号：32272913）。

颜希民|韩东|薛一斌|卢福平|颜巧娟|蒋正强