提升双功能膜蛋白Δ12-羟基化酶/去饱和酶CpFAH12的活性：来自氧化还原伴侣相互作用及电子传递途径的关键见解

《International Journal of Biological Macromolecules》：Enhancing the activity of the bifunctional membrane Δ12-hydroxylase/desaturase CpFAH12: Key insights from redox partner interactions and electron transfer pathways

　　•膜脂肪酸去饱和酶能够催化双键的插入，但它们也可能执行其他修饰反应，如羟基化反应。通过结合分子建模与实验方法，研究人员发现了可能影响这种双功能羟基化/去饱和酶CpFAH12活性和特异性的分子特征。酶的反应特异性可能由氧化还原伴侣间的相互作用决定，而不仅仅是底物结合结构。对CpFAH12酶中与氧化还原伴侣相互作用区域进行突变后，该酶的整体羟基化活性得到了提升。

引言
膜脂肪酸去饱和酶样超家族包含多种整合膜蛋白，它们在脂肪酸修饰方面具有巨大潜力。虽然这些酶主要负责在脂肪酰链中引入双键（图1a），但也有研究指出它们能进行多种其他修饰反应，包括羟基化[1]、环氧化以及脱羧反应[2]。这种多功能性使得它们成为生产高价值脂质的理想工具，因为它们能够改变脂肪酸的饱和度模式[3]以及各种修饰类型[4]。然而，尽管这类酶在生物技术领域具有巨大潜力，但由于膜蛋白生化特性及结构分析的难度，目前对其研究仍较为有限。因此，决定底物选择性、催化效率以及反应特异性的分子机制尚未被充分理解，这也限制了人们设计出具有更好性能或全新功能的酶。

截至目前，该超家族中的酶仅有六种晶体结构被确定：三种硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD1，PDB编号：4ZYO、6WF2和4YMK；分别来自人类和小鼠）；一种鞘脂α-羟基化酶（SCS7P，PDB编号：4ZR0、4ZR1）；以及两种ω-烷烃羟基化酶（AlkB，PDB编号：8F6T和8SBB）。除两种硬脂酰辅酶A去饱和酶（PDB编号：4YMK和6WF2）以及一种ω-烷烃羟基化酶（PDB编号：8SBB）与其相应产物油酰辅酶A[5]和十二醇[6]共同结晶外，其余结构的获取均为未结合状态。所有这些酶都拥有一个非血红素双铁中心，该中心由活性位点中的组氨酸富集结构所稳定。此外，它们还需要依赖涉及不同氧化还原伴侣的电子传递途径，以及氧分子的活化才能发挥催化作用[5]、[7]（图1b）。尽管有了这些结构上的认识，这些酶的催化机制依然不明确。在不同X射线结构中观察到的两个铁原子之间的距离约为6埃，这一距离似乎过大，无法形成双铁-氧复合物。这表明这类膜酶可能采用了某种尚未被报道的反应机制，即利用两种独立的单核氧物种，这类氧物种很可能是由分子氧的活化与分解产生的[8]。或者，在催化反应发生之前，可能需要先经过某种初步的结构重排，使铁中心相互靠近[6]。另外，氧化还原伴侣与膜酶之间的物理相互作用——这对酶的活性至关重要——也尚未被充分了解。最近对烷烃羟基化酶AlkB与其电子供体伴侣Rubredoxin（PDB编号：8F6T）之间天然融合结构的冷冻电镜研究[6]表明，二者之间的相互作用主要由静电作用驱动。

值得注意的是，一些去饱和酶中也存在带有Cytb5结构域的天然融合结构。例如，鞘脂α-羟基化酶（Scs7p）就含有一个N端Cytb5结构域，但目前只有羟基化酶结构域通过X射线晶体学得以解析。同样，参与多不饱和脂肪酸生物合成的人类去饱和酶FADS1和FADS2也具有N端的细胞色素b5融合结构域。不过据我们所知，Δ12-去饱和酶家族的任何成员均未发现此类融合结构。

在脂肪酸去饱和酶样超家族的成员中，Δ12-去饱和酶（FAD2酶类）通常负责催化磷脂上酯化的油酸（C18:1 Δ9）在Δ12位点的去饱和反应，从而生成亚油酸（C18:2 Δ9,12），后者是ω-6多不饱和脂肪酸的关键前体，这类脂肪酸对维持膜流动性起着重要作用。有趣的是，一些主要来源于植物的FAD2酶已经进化出了不同的功能，能够生成一些特殊的脂肪酸，如羟基化脂肪酸、环氧化脂肪酸、乙炔酸或共轭脂肪酸。在这些特殊脂肪酸中，Δ12-羟基化酶（也称为FAH12）已在一些稀有植物物种中被发现，比如蓖麻[1]、Lesquella fendleri[9]、Hiptagae benlagensis[10]等。值得注意的是，许多FAH12酶都是双功能酶，同时具备Δ12-去饱和酶和羟基化酶的功能，能够将油酸（C18:1 Δ9）转化为亚油酸（C18:2 Δ9,12）或蓖麻油酸（C18:1-OH Δ9,12-OH）（图1a）。

在本研究中，我们重点研究了来自紫黑麦菌的真菌双功能Δ12-羟基化酶/去饱和酶CpFAH12[11]。这种酶已被成功用于在多种生物体中生产蓖麻油酸，包括酵母、微藻以及高等植物[11]、[12]、[13]、[14]。CpFAH12有一个结构极为相似的同源酶CpFAD2，后者仅具有单功能Δ12-去饱和酶活性，且与CpFAH12的序列同源性高达86%。尽管序列相似度如此之高，但决定羟基化酶与去饱和酶活性之间的具体因素依然不明。虽然已在植物FAH12[15]、[16]以及真菌CpFAH12[17]中鉴定出与羟基化酶活性相关的关键氨基酸残基，但这些酶的反应特异性背后的精确分子机制至今仍未被阐明。

本研究旨在为揭示控制CpFAH12和CpFAD2去饱和酶及羟基化酶活性的分子因素提供新的见解。我们通过结合多种分子建模方法，研究了这一催化反应的多个方面，包括预测这两种酶的三维结构、详细分析它们的催化结合位点、探究这些酶与其氧化还原伴侣细胞色素b5之间的结合相互作用，最终确定氧化还原伴侣与催化位点之间最可能的电子传递路径。针对通过计算机分析识别出的关键残基，我们进行了定点突变实验。这些重组突变体在油脂代谢能力较强的油酵母Yarrowia lipolytica中表达，之所以选择这种酵母，是因为它具有较为完善的脂质代谢系统[18]。我们的研究结果表明，通过计算机指导对CpFAH12进行工程改造，显著提高了蓖麻油酸的产量，同时还发现了此前未被识别的、能够调控酶活性与特异性的残基。此外，我们的研究还表明，CpFAD2与CpFAH12这两种酶之间的反应特异性，可能是由与氧化还原伴侣相互作用的细微复杂变化以及/或电子传递动态的变化所决定的，而并非仅仅取决于能够结合油酸酰链的底物结合位点的结构。