《International Journal of Biological Macromolecules》：Functional and structural analysis of HviXyn11D xylanase from
Hypocrea virens and its application to xylooligosaccharide production from agro-food by-products
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•首次阐明了HviXyn11D对木聚糖的酶学特性。•分子动力学模拟显示，该酶的底物结合裂隙的开放具有温度依赖性。•HviXyn11D能够将农业食品副产品中的木聚糖转化为XOS。引言全球范围内，农业和林业废弃物不断积累，这凸显出需要有效利用这些废弃物以解决环境与经济问题[1]。水稻
• 首次阐明了HviXyn11D对木聚糖的酶学特性。
• 分子动力学模拟显示，该酶的底物结合裂隙的开放具有温度依赖性。
• HviXyn11D能够将农业食品副产品中的木聚糖转化为XOS。
引言 全球范围内，农业和林业废弃物不断积累，这凸显出需要有效利用这些废弃物以解决环境与经济问题[1]。水稻秸秆、玉米芯以及甘蔗渣等农业副产品产量巨大，但大多被焚烧或丢弃，从而造成严重的环境污染[2]、[3]、[4]。随着全球对可持续能源和废物管理问题的日益关注，将农业食品副产品作为可再生生物质资源加以利用已受到广泛重视[5]、[6]。
半纤维素是农业和林业废弃物中的主要成分，约占其干重的20%–35%[7]、[8]。木聚糖是植物细胞壁中含量第二多的多糖，也是半纤维素的重要结构成分[9]、[10]。木聚糖是一种由β-1,4连接的木糖单元构成的线性聚合物，可通过酶解作用转化为木糖或低聚木糖（XOS）[11]。其中，XOS属于高价值的功能性益生元，能够选择性地促进有益肠道微生物的生长，并带来多种健康益处[12]。因此，XOS已被广泛应用于功能性食品和营养品行业[13]。利用木聚糖酶通过酶法生产XOS因具有高效且环保的优势而备受工业界青睐[13]。
碳水化合物活性酶（CAZy）数据库将多种糖苷水解酶家族，包括GH5、GH7、GH8、GH10、GH11和GH43，归类为木聚糖酶[14]。其中，GH10和GH11家族由于在木质纤维素生物质降解中的核心作用而被研究得最为深入。这类酶具有内切-1,4-β-木聚糖酶活性，能够水解木聚糖主链中的β-1,4糖苷键[15]、[16]。GH11家族的酶因其对木聚糖底物的高特异性以及较弱的纤维素降解能力，常被称为“真正的木聚糖酶”；而GH10酶则对取代型木聚糖链和纤维素的耐受性更强[17]。这类木聚糖酶倾向于生成长度固定的寡糖，而非将木聚糖完全分解为木糖，这一特性有利于功能性XOS的生产[18]。XOS作为一种新兴的高价值功能性碳水化合物，因其益生元特性以及在食品、饲料和制药领域的广泛应用而备受瞩目[19]、[20]。
丝状真菌Trichoderma 的多个物种广泛分布于富含土壤和植物残体的环境中，以其强大的木质纤维素降解能力而闻名[21]。因此，这些物种被广泛用作各种工业应用中的酶源，包括生物燃料生产、造纸业以及饲料改良等领域[22]、[23]、[24]。
Hypocrea virens （同义词：Trichoderma virens 、Gliocladium virens ）能够产生多种纤维素酶、半纤维素酶以及木质素降解酶，这些酶可有效分解复杂的植物细胞壁结构[25]。这类木质纤维素降解酶，包括木聚糖酶和其他半纤维素酶，主要被用于木质纤维素生物质的糖化处理以及农业废弃物的生物转化，例如对空油棕果串的水解，以及通过固态发酵系统生产酶类[26]、[27]、[28]。尽管源自H. virens 的木聚糖酶在生物质降解方面具有潜力，但由于以往的研究大多使用粗制木聚糖酶制剂，其功能特性尚未得到充分了解。有一项最新研究报道了H. virens 木聚糖酶的晶体结构，但该研究仅依靠人工智能预测模型进行比较，未进行详细的酶活性测试或功能分析[29]。因此，H. virens 木聚糖酶的分子功能、催化机制及其工业应用前景仍不明确。
为更深入地了解H. virens 中的木聚糖酶系统，我们检索了蛋白质数据库中的内切-1,4-木聚糖酶基因并对其进行了重新分类。随后，我们研究了HviXyn11D对木聚糖底物的酶学特性。为探究其分子机制，我们确定了HviXyn11D的晶体结构，并进行了分子动力学模拟。此外，我们还证明了利用HviXyn11D可以从农业食品副产品中成功生产XOS。综上所述，这些研究结果不仅深化了我们对H. virens 木聚糖酶系统及HviXyn11D分子功能的理解，也为未来木聚糖酶在工业领域的应用提供了更多依据。
章节摘要 蛋白质制备 蛋白质的克隆与表达操作按照先前描述的方法进行[30]。简而言之，含有木聚糖酶HviXyn11D编码基因的pBT7表达载体（UniProt编号：
G9MJY8 ）被导入
Escherichia coli BL21 (DE3)菌株中。将这些菌株置于添加了0.1?mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃、180rpm的摇床条件下培养。当培养液在600nm处的光密度达到0.4–0.8时，加入异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）来诱导蛋白质的表达。
Hypocrea virens 中木聚糖酶的生物信息学分析以往的研究已经检测了不同H. virens菌株（曾用名Trichoderma virens） 产生的木聚糖酶的酶活性，但这些研究大多使用粗制木聚糖酶制剂测定酶活性，或者并未提供重组酶的相应基因序列信息[26]、[27]、[48]。因此，以往研究中用于测定酶活性的具体木聚糖酶种类尚不清楚。
为明确H. virens 中的木聚糖酶系统，我们开展了生物信息学分析
讨论 木聚糖酶在生物质转化、饲料加工以及造纸等行业中被广泛用作酶类。为进一步提升其在工业领域的应用价值，人们一直在致力于木聚糖酶的蛋白工程改造，以及从天然来源中筛选新的木聚糖酶。
本研究分析了广泛用于生物质降解和工业应用的H. virens 真菌所产生的六种内切-1,4-β-木聚糖酶的氨基酸序列及结构特征
结论 在本研究中，我们对H. virens 基因组中编码的木聚糖酶进行了系统分类，并对HviXyn11D的生化及结构特性进行了分析。研究首次证明，HviXyn11D能够高效地将农业生物质副产品转化为XOS，这凸显了其在工业级XOS生产中的应用潜力。通过对HviXyn11D的晶体结构分析及分子动力学模拟，我们获得了关于该酶的分子层面见解，进一步拓展了人们对GH11木聚糖酶家族的了解，并为其
CRediT作者贡献说明 Ye Lim Kim： 论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，方法学研究，实验分析，数据整理。Bomin Jung： 方法学研究，实验分析，数据整理。Kyeong Min Kim： 方法学研究，数据整理。Ki Hyun Nam： 论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，可视化分析，实验分析，资金获取，正式分析。In Jung Kim： 论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，资源协调，资金获取，概念构思。
资助情况 本项工作得到了韩国国家研究基金会 （NRF）的资助（项目编号：NRF-2022R1I1A1A01072158、RS-2025-16065204以及RS-2026-25496931）。在浦项加速器实验室的MX光束线上进行的实验部分得到了MSIT 和POSTECH 的支持（项目编号：XFEL2025–01）。
利益冲突声明 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢 我们感谢浦项加速器实验室PLS-II的MX光束线工作人员在数据收集方面给予的帮助，同时也感谢韩国科学技术信息院全球科学数据中心（GSDC）在计算支持方面的协助。此外，本项工作还得到了国家超级计算中心的支持，该中心提供了超级计算资源及相关技术支持。在修改手稿期间，我们使用了ChatGPT 5.2软件对英文文本进行了少量编辑和语法校对
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